Инженерия коферментной специфичности формиатдегидрогеназ из метилотрофных бактерий и растений

• Автор: Ясный, Илья Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

МАТЕРИ АЛЫ. Рестрикция ДНК. Трансформация клеток . Выделение плазмидной ДНК. Препаративная наработка биомассы. Выделение формиатдегидрогеназы. Измерение активности нативной и мутантной ФДГ. Определение констант Михаэлиса ФД1. Изучение зависимости кинетических параметров. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. РьеФДГ. Получение мутантов М9, М9, М9. РэеФДГ. ВЫВОДЫ. РбФДГ формиатдегидрогеназа из . КФ 1. Ферменты этого семейства отличаются наличием или отсутствием ионов металлов, простетичсских групп, четырехмерной структурой. Отдельную группу составляют ФДГ, состоящие из двух субъединиц, не содержащие ионов металлов и простетических групп. Данные ферменты относятся к классу специфичных дегидрогеназ 2гидроксикислот. Эти ФДГ были выделены из организмов большинства таксономических групп и, в силу своей относительной простоты, представляют собой удобный объект для модельных исследований в области ферментативного катализа. Механизм реакции, катализируемой ФДГ, также относительно прост, и включает только стадию гидридного переноса без кислотноосновного катализа. Среди ФДГ есть ферменты как с неупорядоченным из бактерий, так и с упорядоченным из дрожжей и микроскопических грибов механизмом действия. Наиболее изучена формиатдегидрогеназа из бактерий . РяеФДГ. Для ФДГ из бактерий . В нашей лаборатории были получены штаммыпродуценты . Методом направленного мутагенеза было получено несколько мутантных ферментов с измененной коферментной специфичностью, с повышенной химической и температурной стабильностью. Вторая по изученности ФДГ фермент из дрожжей i iiii СЬоФДГ. Она обладает примерно такими же кинетическими свойствами, что ФДГ из . ФДГ из . ФДГ из растерши и микроскопических грибов изучены очень плохо. В нашей лаборатории в конце года впервые были получены штаммыпродуценты . ФДГ из растений. Все ФДГ высокоспецифичны к , хотя ферменты из различргых источников отличаются по коферментной специфичности. ФДГ из пекарских дрожжей vii 5сеФДГ абсолютно специфичны к 4, а ФДГ из бактерии могут катализировать окисление формиата в присутствии Коферментная специфичность к ФДГ из дрожжей i iiii на два порядка выше аналогичного показателя дтя РбсФДГ. Изучение механизмов связывания коферментов в активном центре ФДГ методом направленного мутагенеза является важной фундаментальной и практической задачей. В литературном обзоре приведены наиболее удачные примеры работ по изменению коферментной специфичности зависимых дегидрогеназ. Целью данной работы стало дальнейшее улучшение свойств зависимых ФДГ из бактерий . В связи с отсутствием в литературе данных о коферментной специфичности ФДГ из растений, нашей целью было также получение зависимых ФДГ из растений и изучение их свойств. Молекула представляет собой динуклеотид, состоящий из остатков азотистых оснований аденина и никотинамида, соединенных пирофосфатной группой через остатки рибозы рис. I. 1

он он

. Рис. Однако в живых клетках эти соединения выполняют принципиально различные функции. Это позволяет клетке осуществлять раздельную регуляцию процессов получения , необходимого для синтеза АТР, и синтеза различных соединений с участием . Осуществление такого разделения возможно в двух случаях если процессы анаболизма и катаболизма разделены пространственно или если ферменты, катализирующие эти процессы, высокоспецифичны по отношетшю к коферментам. Согласно общепринятому мнению, прокариоты возникли в процессе эволюции раньше эукариот, а, как известно, прокариотические клетки не разделены на компартменты. Поэтому у прокариот, вероятно, в ходе эвошоции появились окислительновосстановительные ферменты с очень высокой специфичностью к одному из коферментов или . Таким образом, эти ферменты представляют собой прекрасный пример молекулярного распознавания близких соединений биологическими системами. По современным данным, распределение динуклеотид связывающих ферментов в природе по специфичности выглядит следующим образом табл. Таблица 2. Доля ферментов с дуальной специфичностью мала по сравнению с долей моноспецифичных ферментов.