Органофосфатгидролаза : Механизм действия, стабилизация, белковые и металлокомплексные функциональные аналоги

• Автор: Сергеева, Виктория Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с.

ВВЕДЕНИЕ.

ОВЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Органофосфатгидролаза.

1.1. Фосфорорганнчсскис нейротоксины.

1.1.1. Структура, свойства, токсичность

1 Способы деградации фосфорорганическнх соединений

1.2 Органофосфатгидролаза.

1.2.1. Физикохимические характеристики, субстратная специфичность.

1.2.2. Структура активного цезггра, механизм действия.

Глава 2 Стабилизация органофосфатгидролазы

Глава 3 Гидролитические ферменты, имеющие сходный активный центр

Глава 4. Комплексы металлов как модели активных центров фосфатгидролизующих
ферментов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1.1. Приборы и хатериалы.
1.2. Выделение и очистка органофосфатгидролазы
1.3. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона.
1.3.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона. катализируемой органофосфаттидролазой
1.3.2. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона в присутствии субтилизнна, трипсина,
папаина, термолизина и карбоксипептндазы А
1.3.3. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона
в присутствии кислой фосфатазы
1.4. Иммобилизация органофосфатгидролазы
1.4.1. Химическая модификация криогеля ПВС
глутаровым альдегидом.
1.4.2. Иммобилизация органофосфатгидролазы на альдегилосодержашем криогелс ПВС.
1.5. Приготовление комплекса органофосфатгидролазы с полиэлектролитом.
1.6. Синтез циклометалированных комплексов с арилоксимами.
1.6.1. Общая методика синтеза цикломстзллированных комплексов П с замещенным ацеюфеноноксимами
1.6.2. Синтез цнклометаллированного комплекса РУ
комплекс
1.6.3 Синтез цикяоиалладировапного кохшлекса Р1 с ацетофенон
оксимом комплекс 7.
1.6.4. Синтез циклоплатинированного комплекса РЦ1Г с ацетофеноноксимом комплекс 6.
1.7. Кинетические исследования пшролиза эфиров тиофосфорной кислоты в присутствии комплексов .
1.8. Определение кинетическою изотопного эффекта реакции гидролиза паратмона. катализируемой комплексом 6в
1.9. Измерение активационных параметров реакции гидролиза паратиона в
присутствии комплекса 6а
1 Кинетические исследования гидролиза дсмстонаЯ в присутствии циклоплатинированных и циклопалладированных арилоксимов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 1. Гидролиз фосфорорганических соединений в присутствии гидролитических
ферменгов разных классов.
Глава 2 Влияние органических аминов на каталитическую активность
органофосфатгидролазы. механизм действия органофосфатгидролазы.
2.1. Амины, активирующие органофосфэтгидролазу
2.2. Амины, ингибирующие органофосфаггидролазу
2.3. Механизм действия органофосфатгидролазы
Глава 3. Влияние органических растворителей на каталитическую активность органофосфатгидролазы
3.1. Влияние полярных органических растворителей
3.2. Кинетические закономерности поведения органофосфатгидролазы в двухфазных системах с неполярными органическими растворителями
3.3. Образование нековалентных комплексов с полнэлектролкгами.
3.4. Совместное использование иммобилизации и комплсксообразования с полиэлектролитом для
стабилизатщи органофосфатгидролазы.
Глава 4 Гидролиз фосфорорг а н и чес ки х соединений в присутствии окенмных комплексов платины и палладия.
4.1. Гидролиз три эфиров фосфорной кислоты в присутствии комплексов .
4.2. рНзависпмости реакции гидролиза паратиона в присутствии комплексов .
4.3. Активационные параметры реакции гидролиза паратиона, катализируемой комплексом 6а. Влияние ионной силы иа гидролиз паратиона в присутствии комплексов .
4.4. Механизм гидролиза триэфиров тиофосфорной кислоты комплексами
4.5. Гидролиз деметонаБ в присутствии комплексов
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Продемонстрирована необходимость присутствия ионов металла в активном центре фермента для эффективного гидролиза триэфнров фосфорной кислоты на примерах ферментов различных классов. Исследованы кинетические закономерности реакций гидролиза фосфорорганических соединений, катализируемых ОФГ в присутствии органических растворителей различной природы. Определены кинетические параметры реакции для различных бинарных водноорганических систем в отсутствии и присутствии полиэлектролитов, показана высокая стабильность нековалентного фермектполнэлектролнтного комплекса против инактивации органическими растворителями. Разработан метод иммобилизации фермента в гель поливинилового спирта в присутствии полиэлектролита, позволяющий получить высокоактивный и стабильный препарат фермента. Созданы металлокомплексные катализаторы гидролиза фосфорорганических нсйротоксимов на основе циклометаллнрованпьтх комплексов платины и палладия, имитирующие действие ОФГ. Показано, что механизм катализа гидролиза трифосфатов циклоплатинированными и циклопалладированными арилокенмами включает связывание субстрата через комилексообразование с ионом металла, что повышает элекгрофильность атома фосфора, и последующую внутримолекулярную атаку координированным нуклеофилом, в роли хоторого выступает окенматион. Полученные катализаторы обладают высокой активностью и демонстрируют высокую специфичность по отношению к серусодержащнм эфирам фосфорной кислоты. Найдено, что изученные комплексы способны промотировать гидролиз ненротоксина деметона, являющегося аналогом УХгазов. Структура. Фосфороргаиичеекие нейротокснны представляют собой эфиры оргофосфорной и алкнлфосфоновых кислот и их производных. К таким фосфорорганичсскнм соединениям относятся широко применяемые в сельском хозяйстве пестициды и боевые отравляющие вещества нервнопаралитического действия. В Таблице I представлены структурные формулы некоторых наиболее распространенных фосфорорганических пестицидов и боевых отравляющих веществ . Кумафос С2НРОЦ. А. X. Обзор литературы. Органофосфатгидролаза. Ди изопро 1ил фторфосфат . Токсичность фосфорорганических соединений связана с их способностью ингибировать ацстилхолннэстеразу 1, что приводит к накоплению ацетилхолина в синапсах пространствах между нервными клетками нейронами центральной и перефернческой нервной системы. Механизм ингибирования включает в себя необратимое фосфорнпирование остатка ссрина в активном центре ацетилхолинэстсразы. Обзор литературы. Наиболее важный фактор, определяющий токсичность фосфорорганнчсских соединений реакционная способность фосфорного центра, которая, в свою очередь, определяется природой и размером связанных с атомом фосфорз групп. Соединения, в которых атом фосфора ковалентно связан с атомом кислорода, более токсичны, чем аналогичные соединения с атомом серы в таком же положении. Так. Р, связью. Значения параметра 1Лм. Таблице 2 3. Таблица 2 Токсичность некоторых фосфорорганических пестицидов и боевых отравляющих веществ. Фосфорорганнческое соединение по отношению к параоксону. Табун 3 0. Зарин 1. Зоман 1 0. УХ 0. Большинство фосфорор1дничсских инсектицидов подвергаются фотолизу. Обзор литературы. Фотолиз инсектицидов в растворе протекает значительно быстрее, чем фотолиз инсектицидов, адсорбированных на почвах или других поверхностях. Другой традиционный путь деградации фосфорорганических нсйротоксинов щелочной гидролиз. Константы скорости щелочного гидролиза суммированы в Таблице 3. Таблица 3. Константы скорости спонтанного и щелочного гидролиза некоторых фосфорорганических соединений . Параоксон 7. Паратион 9. Метилпаратнон 2. Деметон8 6. Ацефат 6. Малатнон 1. Третий из наиболее часто применяемых способов уничтожения органофосфатов сжигание. Типичная процедура представляет собой нагревание до 8 С в течение минут в закрытой камере. В последнее время широкое развитие получил альтернативный способ деградации фосфорорганических соединений при помощи биологических систем и ферментов. Впервые фермент, способный катализировать гидролиз органофосфатов, был выделен из плазмы крови млекопитающих 7.