Структура над-зависимой гидрогеназы водородокисляющих бактерий Alcagenes eutrophus Z-1 и кинетические особенности ее действия

• Автор: Газарян, Ирина Георгиевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 c. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I.Свойства НАДзависиыых гидрогеназ .

..Общая характеристика ферментов класса гидрогеназКФ 1..

1.2.Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ .

1.3.Исследования по стабильности и кинетике действия гидрогеназ .

I.А.Общая характеристика НАДзависимых гидрогеназ КФ 11.2.

1.5.Схемы выделения высокоочищенных НАДзависимых гидрогеназ,стабильность ферментов,представления о механизме активации .

1.6.Кинетические свойства НАДзависимых гидрогеназ

1.7.Пути возможного практического использования

НАДзависимых гидрогеназ

ГЛАВА 2.Особенности поведения диссоциирующих ферментных
2.1.Зависимость удельной ферментативной активности от концентрации фермента для равновесия типа
2.2.Кинетика диссоциацииассоциации ферментов вызываемая изменением условий
2.3.Диссоциирующие ферментные системы типа мономера димер тетрамердля случая активного тетрамера
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА 3.Материалы и методы
3.1.Материал ы
3.2.Метод ы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛйВа 4.Очистка гидрогеназы водородокисляющнх бактерий А .оЖъоркиь I до гомогенного состояния методом гидрофобной хроматографии
4.1.Методика очистки.
4.2.Спектральные характеристики гомогенной гидрогеназы
4.3.Определение молекулярного веса НАДзависимой гидрогеназы из 1
4.4.СубъедшичныЙ состав НАДзависимой гидрогеназы
ГЛАВА 5.Определение равновесной и кинетических констант
процесса диссоциации гидрогеназы
ГЛАВА 6.Инактивация гидрогеназы под действием мочевины.
ГЛАВА 7.Кинетические свойства НАДзависимой гидрогеназы,
проявляемые при катализе НАДНдегидрогеназной реакции
7.1.Кинетические параметры НАДНдегидрогеназной реакции.
7.2.Кинетический метод альтернативных субстратов.
7.3.Ингибирование НАДНдегидрогеназной активности субстратами,продуктами и аналогом продукта
ГЛАВА в.Формальная кинетика реакции восстановления НАД
водородом.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


НАДзависимые гидрогеназы представляют интерес с точки зпения теоретической энзимологии,поскольку их отличает сложная четвертичная структураналичие нескольких видов простетических групп и способность проявлять несколько типов каталитической активности с широким спектром субстратов. Гидрогеназы водородокисляющкх бактерий могут являться удобными модельными
обьектами для исследования подходов к выяснению механизмов действия и стабилизации подобного рода сложных ферментных структур. Наличие внутримолекулярной электронтранспортной цепи позволяет считать их моделью полиферментных систем,объединенных в одном олигомерном ферменте. Решение важных практических задач,связанных с возможным использованием НАДзависимых гидрогеназ,в частности,создание технологического катализатора на основе гидрогеназы,невозможно без всестороннего исследования ее физикохимических свойств и механизма действия. Разработанные к настоящему времени методы выделения препаратов гомогенных гидрогеназ представляют собой трудоемкие процессы,приводящие к низким выходам активного фермента. В литературе полностью отсутствуют сведения о влиянии четвертичной структуры НАДзависимой гидрогеназы на ее стабильность,не проводилось систематического изучения ее кинетических свойств. Целью настоящего исследования являлисьразработка простого и эффективного метода выделения и очистки НАДзависимой гидрогена зы водородокисляющих бактерий ЛкаЬдгпс штамм I,изучение четвертичной структуры фермента и ее связи с каталитической активностью,а также выяснение кинетических закономерностей протекания различных реакций катализируемых ЙАДзависимоЙ гидрогеназой. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА Г. СвойЩрва НАДзависимых гидрогеназ. Общая характеристика ферментов группы гидрогеназ КФ 1. Термин гидрогеназа был предложен в году Стефенсоном и Стиклендом 1 для фермента,обуславливающего способность клеток ииисАа, ьо поглощать водород. В настоящее время гидрогеназы обнаружены у многих микроорганизмов. Только среди хемотрофных бактерий известно до родов,представители которых обладают гидрогеназной активностью. Гидрогеназную активность проявляют некоторые эвгленовые микроводоросли,отдельные виды морских форы зеленых,бурых и красных водорослей. Имеются сообщения о наличии гидрогеназной активности у лишайников,некоторых простейших и даже у эмбрионов лягушки 2 Гидрогеназы играют важную роль в метаболизме многих видов микроорганизмов. Они участвуют в энергообеспечении клетки,поддержании внутриклеточной среды на благоприятном для жизнедеятельности уровне,в процессах ыетаногенеза,азотфиксации и др. Гидрогеназы локализованы в различных частях клеткиыембране. Локализация фермента определяет лишь некоторые из его свойств,тем не менее в литературе утвердилось деление гидрогеназ на растворимые и мембраносвязанные. Так,различают цитохром С3,НАД,флаводоксин и ферредоксинзависимые гидрогеназы. Следует отметить при этом,что практически все гидрогеназы взаимодействуют с целым рядом искусственных субстратов метилвиологеном,бензилвиологеном,
феррицианидом,2, бдихлофенолиндофеноломДХФИФ,метиленовой синыох и др. Способность гидрогеназ образовывать прочные комплексы с другими ферментами и белками,а также крайняя их лабильность и чувствительность к присутствию кислорода приводят к большим трудностям в получении гомогенных препаратов. Число работ,выполненных на гомогенных препаратах гидрогеназ, тем не менее,увеличивается с каждым годом. В таблице I представлены основные характеристики гомогенных гидрогеназ. Как следует из приведенных в табл. В большинстве случаев,гидрогеназы имеют сложную четвертичную структуру,характер организации которой оказывает решающее влияние на свойства фермента. По мнению Чена и Мортенсона Ч к общеми свойству гидрогеназ можно отнести близость молекулярного веса ферментов к 0 или наличие субъединицы с молекулярным весом,близким к 0. Главным и общим свойством для всех гидрогеназ является присутствие в молекуле железосерных кластеров типа Г . ТАБЛИЦА I. ВыходыгЮОг сухого
6. Молекулярный вес,тыс. Отношение числа атомов нелеза и серы в молекуле
9. Характеристики ЭПРспектров
восст. Продолжение Таблицы I. ФМН
II. II. Х, 2,
Продолжение Таблицы I. ЛлЬллй. СО РриЛ ли. ИЗ
8. ЧСрСр ,д
слонн. Продолжение Таблицы I. Лиу а, г аАс саЬсьо и.