Определение структуры и динамических свойств комплексов дигидрофолатредуктазы человека и L.Casel с антибактериальным препаратом триметопримом

• Автор: Ковалевская, Надежда Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 154 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА, СТРУКТУРА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ИНГИБИТОРАМИ НАДФНЗАВИСИМОЙ ДИГИДРОФОЛАТРЕДУКТАЗЫ

2.1.1. Общие сведения

2.1.2. Структура фермента.

2.1.3. Механизм действия

2.1.4. Взаимодействие с ингибиторами

2.2. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКУРЫ И ДИНАМИКИ БЕЛКОВ

2.2.1. Общие сведения о структурных и динамических исследованиях БЕЛКОВ

2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР.
2.2.3. Изучение динамики белков в растворе с помощью релаксационных
ЭКСПЕРИМЕНТОВ ЯМР.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. МАТЕРИАЛЫ
3.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.2.1. Получение образцов.
3.2.2. Спектроскопия ЯМР
3.2.3. Обработка спектров ЯМР.
3.2.4. ОТНЕСЕНИЕ СИГНАЛОВ В СПЕКТРАХ ЯМР
3.2.5. Отнесение ЯЭО и получение других ограничений.
3.2.6. Расчет и уточнение структуры
3.2.7. Визуализация и сравнительный анализ белковых структур.
3.2.8. Анализ релаксационных данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСОВ ДГФР
4.1.1. Тройной комплекс ДГФР человека с ТМП и НАДФН
4.1.2. Бинарные комплексы ДГФР .слдасТМП и НАДФН
4.2. СРАВНЕНИЕ СТРУКТУР ТРОЙНОГО КОМПЛЕКСА ДГФР ЧЕЛОВЕКА И КОМПЛЕКСОВ ДГФР САБЕ.
4.2.1. Сравнение общей топологии ДГФР.
4.2.2. Сравнение структурных параметров белковой глобулы в серии компл ексов ДГФР.
4.2.3. Сравнение строения центров связывания лигандов в серии комплексов ДГ ФР.
4.3. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВОЙ ЦЕПИ В СЕРИИ КОМПЛЕКСОВ ДГФР ЧЕЛОВЕКА И ЕСАБЕ.
4.3.1. Влияние связывания ТМП и НАДФН на динамику белковой цепи ДГФР Ь.сазе.
4.3.2. Динамические свойства белковой цепи ДГФР человека в тройном комплексе с ТМП и НАДФ ,.
5. ВЫВОДЫ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


VIVVI. I I I I I I I I I I I I
. I I I. VV. I I I I
V VIК I I. Рнс. З. Выравнивание аминокислотных последовательностей ДГФР про и эукариот. Строго консервативные осгатки обозначены жирным шрифтом. Консервативные области выделены темным цветом. Над аминокислотной последовательностью указаны элементы вторичной структуры, характерные для всех форм ДГФР. Стрелками обозначены Рлисты, цилиндрами аспирали. На сегодняшний день в банке белковых структур i содержится около 0 структур ДГФР из различных организмов в комплексах с разнообразными лигандами 2. На рисунке 4 представлены структуры ДГФР человека и . Рис. Структуры ДГФР человека слева и Е. Н справа в двух ортогональных проекциях сверху и снизу. На примере комплексов с фолатом код доступа в РЭВ для ДГФР человека и Е. Н ШЯР и ШХ7 соответственно 3,4. Лиганд на рисунке не показан. Большинство форм ДГФР состоит из одной полипептидной цепи и существует в виде мономера. Рис. Общая топология ДГФР на Рис. Два субдомена на примере комплекса примере комплекса фермента . НАДФН, код триметопримом и НАДФН, код доступа в доступа в 12 4. Фолат показан 1 5. НАДФН красным. Восемь листов образуют жесткий каркас и обозначаются латинскими буквами АН. За исключением Стерминального листа, все листы параллельны. Четыре аспирали крепятся к листовому каркасу по две с каждой стороны и имеют буквенные обозначения В, С, Е и . В конструкции можно выделить три основные петли петлю I она же петля , изза наличия соответствующего остатка в ферменте . В некоторых структурах наблюдаются дополнительные петли и аспирали. Дисульфидные мостики, как правило, отсутствуют. В белке выделяют два субдомена аденозинсвязывающий и каталитический рис. Первый состоит из листов В, С, , Е и аспиралей С и Е и участвует в
связывании аденозиновой части НАДФН. Каталитический домен состоит из листов А, , , Н, аспиралей В, и трех основных петель. Между тяжами А и Е наблюдается разрыв нескольких водородных связей, образующий границу раздела субдоменов. Там же находится сайт связывания никотинамидного фрагмента кофактора. Птеридиновое кольцо фолата находится рядом, между аспиралями В и Е. Таким образом, достигается расположение донора и акцептора гидридиона атома С4 молекулы НАДФН и атома С6 молекулы ДГФ соответственно на ВандсрВаальсовом расстоянии друг от друга. Реагенты спрятаны от растворителя подвижной и высококонсервативной петлей I, которая меняет конформацию в ходе каталитического цикла. Движения петли I остатки в ДГФР . ДГФР в ходе реакции см. Птеридиновый фрагмент субстрата находится практически в центра белка, образуя гидрофобные контакты с боковыми цепями остатков и , а также широкую сеть водородных связей здесь и далее нумерация дана на примере ДГФР . Ароматическое кольцо иаминобензоилглутаминового остатка субстрата располагается в гидрофобном окружении боковых цепей консервативных остатков , и рис. Аминобензоилглутаминовый остаток субстрата образует электростатический контакт с консервативным остатком , находящимся почти у поверхности белка 4. Субстрат вовлечен в образование сети водородных связей с участием амидных фрагментов остатков 4, , 4, боковых цепей остатков 6 и Тгр, а также долгоживущих молекул воды, обнаруженных в районе посадки птеридиновго кольца методами РСА и спектроскопии ЯМР 68. Тот факт, что молекула воды остается прочно связанной даже в растворе, дает основания для предположения об участии этой молекулы в передаче протона к 5 в ходе катализа см. V

xV
I
Рис. Схема связывания птериди Рис. Схема связывания кофактора с ДГФР нового кольца дигидрофолата с ДГФР . Строение активного центра связывание кофактора Кофактор НАДФН занимает бороздку, которая расположена преимущественно на поверхности фермента. На рисунке 8 показаны упомянутые выше остатки на примере комплекса ДГФР . НАДФН. Адениновос кольцо находится в кармане, образованном , i и V . Его положение достаточно жестко определено плотными гидрофобными контактами. Рибозное кольцо аденозина находится рядом с , i 1 и I 2. НАДФН 5.