Роль хлорид-анионов в функционировании ангиотензин-превращающего фермента

• Автор: Моисеева, Наталья Анатольевна
• Шифр специальности: 02.00.15, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 165 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава 1 Общие сведения об ангнотензинпревращающем ферменте

1.1. Локализация и функции ангиотензннпревращающего фермента в организме.

1.2. Структура гена ангиотензннпревращающего фермента

1.3. Первичная структура ангиотензннпревращающего фермента и особенности углеводной компоненты фермента

1.4. Пространственная структура ангиотензннпревращающего фермента

1.4.1. Пространственная структура Сдомена ангиотензннпревращающего фермента человека
1.4.2. Пространственные структуры комплексов Сдомена анпютензинпревращающего фермента с лизиноприлом, каптоприлом и эналаприлатом
1.4.3. Пространственные модели Ыдомена ангиотензинпревращающего фермента и комплекса Ндомена с лизиноприлом.
1.4.4. Механизм функционирования активных центров ангиотензннпревращающего фермента.
1.5. Каталитические свойства отдельных Ы и Сдомснов ангиотензннпревращающего фермента и доменов в составе соматического фермента
Глава 2 Активация ангиотензннпревращающего фермента хлориданионами.
2.1. Влияние хлориданионов на Ы и Сдомены ангиотензннпревращающего фермента
2.2. Аминокислоты, отвечающие за связывание хлориданионов в ангнотензинпревращающем ферменте.
2.3. Хлоридсвязывающие центры в Сдомене и в гомологах ангиотензннпревращающего фермента
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3 Материалы и методы исследования
3.1. Материалы.
3.2. Методы исследования
3.2.1. Синтез аффинного сорбента
3.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензин
превращающего фермента.
3.2.3. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензинпревращающего фермента.
3.2.4. ПолучениеТ4домена соматического ангиотензинпревращающего фермента.
3.2.5. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента
3.2.6. Обессоливание ангиотензинпревращающего фермента.
3.2.7. Подготовка образцов к секвенированию
3.2.8. Кинетические измерения.
3.2.9. Исследование структуры ангиотензинпревращающего фермента
методами биоинформатики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава 4 Получение трех форм ангиотензинпревращающего фермента
4.1. Получение и характеристика соматического ангиотензин
превращающего фермента быка
4.2. Получение и характеристика тестикулярного ангиотензин
превращающего фермента быка
4.3. Получение Ыдомена ангиотензинпревращающего фермента быка
4.3.1. Каталитические характеристики Ыдомена ангиотензинпревращающего фермента
Глава 5 Влияние хлориданионов на кинетические характеристики
ангиотензинпревращающего фермента
5.1. Влияние хлориданионов на кинетические параметры гидролиза
СЬгРЬеНБЬеи под действием С и Ыдоменов ангиотензинпревращающего фермента
5.1.1. Определение влияния ионной силы раствора на активности С и Ыдомеиов ангиотензинпревращающего фермента быка
5.1.2. Определение механизма действия хлориданионов в реакции гидролиза СЬгРЬеПзЬеи под действием Ы и Сдоменов ангиотензинпревращающего фермента.
5.2. Влияние хлориданионов на кинетические параметры гидролиза РаРИсвуву под действием С и Ыдомеиов аигиотензии
превращающего фермента.
5.2.1. Определение механизма действия хлориданионов в реакции гидролиза под действием и Сдоменов ангиотензинпревращающего фермента.
5.3. Влияние хлориданионов на кинетические параметры гидролиза i под действием соматического ангиотензинпревращающего фермента и определение механизма действия хлориданионов в реакциях, катализируемых данной формой фермента.
Глава 6 Построение моделей пространственных структур и Сдоменов
ангиотензинпревращающего фермента быка
6.1. Сравнение аминокислотных последовательностей и Сдоменов
ангиотензинпревращающего фермента быка и человека.
6.2. Общие сведения о пространственных моделях и Сдоменов ангиотензинпревращающего фермента быка
6.2.1. Аминокислоты, отвечающие за связывание субстрата i в и Сдомснах ангиотензинпревращающего фермента быка
6.2.2. Пространственное расположение потенциальных центров связывания хлориданионов в моделях и Сдоменов ангиотензинпревращающего фермента быка
6.2.3. Роль С в функционировании однодоменных форм ангиотензин
превращающего фермента быка.
6.2.4. Оценка разницы в энергиях связывания хлориданиона С с
и Сдоменами ангиотензинпревращающего фермента.
6.2.5. Роль СП в функционировании одподомеиных форм ангиотензинпревращающего фермента быка
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, было выявлено влияние дипептидазной активности АГ1Ф, а не Iазиой активности, на процесс размножения . Поэтому вопрос о причинах участия АПФ в репродуктивной функции остается открытым. АПФ. Большая устойчивость домена по сравнению с Сдоменом к действию протсиназ была использована исследователями в дальнейшем для целенаправленного получения домена из соматической формы фермента i vi. АПФ человека был получен с помощью тепловой или щелочной денатурации соматического АПФ из почек человека с последующей обработкой его калликрсином или плазмином . АПФ как по физикохимическим, так и по кинетическим характеристикам. Секвенирование концевых аминокислот подтвердило соответствие полученных 0 кДа фрагментов домену АПФ. Обе формы АПФ соматическая и тестикулярная считываются с единственного гена. Полная интронэконовая структура гена АГФ человека, установленная рестрикционным картированием генных клонов и секвенированием граничных участков интронэксон , содержит нитронов и эксонов. Транскрипция мРНК соматического АПФ осуществляется с 1го до ого эксона, но ый эксон выщепляется из первичной РНК в ходе сплайсинга. Транскрипция мРНК тестикулярного фермента осуществляется с го до ого эксона . В гене АПФ существует два функциональных промотора соматический и тестикулярный . Промотор соматического АПФ находится на 5 стороне первого эксона гена. Промотор тестикулярного АПФ расположен на 5 стороне 5конца мРНК тестикулярного фермента, причем сайт инициации трансляции находится внутри гена АПФ. Таким образом, ый нитрон, расположенный с 5конца го эксона, специфичного для тестикулярной формы, является предполагаемым промотором тестикулярного АПФ . Структура гена АПФ человека позволяет подтвердить предположение, что в ходе эволюции произошла дупликация исходного гена. Поэтому уникальное строение соматического АПФ, содержащего в составе одной полипептидной цепи два каталитически активных домена, является результатом данного эволюционного изменения. Эксоны 4 и , кодирующие два гомологичных домена фермента, схожи как по размеру, так и по последовательности. А размеры нитронов, напротив, не являются консервативными . Соматический АГ1Ф человека синтезируется как единая полипептидная цепь, состоящая из аминокислотных остатков 1. В процессе постгрансляционной модификации с Ыконца фермента отщепляется сигнальный пептид, представляющий собой гидрофобный участок, состоящий из аминокислот 1. Оставшиеся аминокислоты подразделяются на следующие участки Сконцевые аминокислот находятся внутри клетки и составляют цитоплазматический домен, далее идет трансмембранный участок, находящийся внутри клеточной мембраны и прикрепляющий основную часть белка, расположенную вне клетки, к поверхности клетки рис. Трансмембранный участок представляет собой гидрофобную последовательность из аминокислот. Внеклеточная часть фермента содержит два гомологичных домена, названных в соответствии с их расположением Ы и Сдоменами рис. Между Сдоменом и трансмембранным участком, в непосредственной близости от клеточной мембраны, располагается так называемый примембранный участок, в котором находится пептидная связь, разрываемая при шеддинге фермента с поверхности клетки , . Гомология между Ы и Сдоменами соматического АПФ составляет около , но достигает , если рассматривать в каждом домене последовательность из аминокислот, содержащую остатки, входящие в состав активного центра. Рис. Структура соматического и тестикулярного АПФ. Соматический АГФ блка, использованный нами как объект исследования, совпадает с ферментом человека по общему количеству аминокислотных остатков, но сигнальный пептид у фермента быка состоит из аминокислот. АПФ гликопротеин с относительно высоким содержанием углеводных остатков. Ферменты, выделенные из различных источников, Сличаются по содержанию, качественному составу и соотношению углеводных компонентов , , , , , . Соматический АГФ гликозилирован по Ытипу олигосахаридные цепи присоединяются к остаткам Аяп, находящимся на поверхности белка, через азот Ыацетилглюкозамина .