Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica и ее мутантные формы: получение, свойства, применение

• Автор: Малошенок, Лилия Георгиевна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

Биолюминесценция присуща многим живым организмам, например, бактериям, моллюскам, насекомым и представляет собой уникальный случай биоконверсии химической энергии в световую 1, 2. В основе лежит катализируемое ферментом люциферазой окисление органического субстрата люциферина кислородом воздуха. Одним из важнейших направлений фундаментального изучения люцифераз является выяснение связи между спектрами биолюминесценции и структурой люциферазы светляков. В настоящее время, известны первичные структуры люцифераз, выделенных из различных видов насекомых 3. Сравнительный анализ первичной и третичной структуры люциферазы светляков из различных источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами и структура излучателя, идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых. В то же время максимумы спектров биолюминесценции могут варьироваться в интервале от 0 до 0 нм. Это различие в спектрах биолюминесценции для нативных и мутантных форм люцифераз до сих пор не нашло единого объяснения, хотя выдвинуто несколько теорий для объяснения механизма регулирования спектров биолюминесценции , . Литературные данные показывают , что сдвиги в спектрах биолюминесценции могут наблюдаться при мутациях аминокислотных остатков, расположенных на различных участках аминокислотной последовательности. Мутации в активном центре фермента приводят как к сдвигу максимума биолюминесценции, так и к изменению формы спектра, при этом в десятки раз уменьшается каталитическая активность люциферазы, ухудшается связывание субстратов с ферментом. Таким образом, актуальным является выяснение механизма, благодаря которому реализуются наблюдаемые изменения в спектрах биолюминесценции, особенно при мутациях остатков, локализованных вне активного центра. Это, возможно, позволит получать мутантные формы люциферазы с различными максимумами спектров биолюминесценции без существенного изменения других физикохимические свойств фермента. Одним из таких остатков, повидимому, является i3, мутация которого в люциферазе светляков i i случайным мутагенезом привела к сдвигу максимума биолюминесценции от 0 до 0 нм без существенного изменения ферментативной активности . В связи с этим исследование остатка i3 вызывает интерес, поскольку он высококонсервативен для всех люцифераз насекомых, не входит в активный центр, но его мутации могут изменить спектр биолюминесценции. С другой стороны, исследование биолюминесцентной системы имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, поскольку люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях i vi и i viv . АТФ . АТФ, повысить активность АТФреагента, снизить расход фермента для получения реагента. Использование люцифераз, генерирующих свет в различной области видимого спектра, открывает дополнительные аналитические возможности для биолюминссцентного микроанализа . Данная работа посвящена изучению физикохимических свойств рекомбинантной люциферазы светляков Ь. Иса и ее мутантных форм по остатку 3. Целью работы являлось получение методом сайтнаправленного мутагенеза мутантных форм люциферазы светляков Ь. Иса по остатку , изучение их каталитических свойств, термостабильности, спектров биолюминесценции и разработка метода получения высокоактивного и стабильного АТФреагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков. II. Люцифсраза светляков катализирует окисление люциферина светляков кислородом воздуха в присутствии 4 , , , которое сопровождается излучением видимого света с квантовым выходом около . Механизм окисления люциферина подробно изучен и предложена схема реакции рис. На первой стадии фермент связывается с субстратами люциферином 1 и аденозин5трифосфатом АТФ. В таком тройном ферментсубстратном комплексе люциферин ковалентно взаимодействует с АТФ, и в результате образуются смешанный ангидрид карбоновой и фосфорной кислот люцифериладенилат 2 и пирофосфат. Далее люцифериладенилат через ряд промежуточных стадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид диокситанон

Рис. I. Схема окисления люциферина .