Активность и стабильность β-галактозидаз

• Автор: Пилипенко, Ольга Станиславовна
• Шифр специальности: 02.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Источники, структура и механизм действия ргалакгозидаз

1.1. Классификация ргалактозидаз

1.2. рГалактозидазы растений

1.3. РГапактозидазы млекопитающих и человека

1.4. рГалактозидазы микроорганизмов

1.4.1. Бактериальные ргалактозидазы.

1.4.2. Грибные и дрожжевые Ргалактозидазы.

1.4.3. Третичная структура ргалактозидаз

1.5. Механизм каталитического действия Ргалактозидаз.

1.5.1. Каталитическая активность Ргалактозидаз
1.5.2. Механизм каталитического действия ргалактозидаз
1.5.3. Активаторы и ингибиторы ргалактозидаз
Глава II. Биокатализаторы на основе ргалактозидазы
2.1. Практическое использование ргалактозидаз
2.2. Адсорбция и другие физические методы иммобилизации
р гада кгоз даз.
2.3. Химические методы иммобилизаци Ргалактозидаз
ковалентное связывание.
2.4. Свойства и применение иммобилизованных Ргалактозидаз
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава III. Объекты и методы исследования.
3.1. Характерисгика ферментов и использованных химических
реактивов
3.1.1. Ферменты
3.1.2. Химические реактивы.
3.1.3. Буферные растворы.
3.2. Определение ферментативной активности ргалактозидазы
3.3. Методика изучения термоинактивации фермента.
3.3.1. Термоинактивация ргалактозидазы в растворе.
3.3.2. Термоинактивация Ргалактозидазы в адсорбционных слоях
3.4. Адсорбционная иммобилизация ргалактозидазы
3.4.1. Адсорбционная иммобилизация ргалактозидазы на силикагеле
3.4.2. Получение совместных адсорбционных слоев фермента и полисахаридов.
3.5. Количественное определение белка методом Брэдфорда.
3.6. Оценка погрешностей в определении экспериментальных величин
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава IV. Механизм реакции гидролиза гликозидной связи субстрата в активном центре Ргалактозидазы из ii i в рамках
теории цепей перераспределения связей.
4.1. Механизм реакции.
4.2. Влияние метанола на гидролиз орто и паранитрофенилРгалактопирапозидов ргалактозидазой из ii i
4.3. Структурный анализ аминокислотных последовательностей .
ргапактозидаз из различных источников
Глава V. Термоинактивация Ргалактозидаз из различных источников
5.1. Ассоциативнодиссоциативные процессы в растворах
Ргалактозидаз.
5.1.1. Диссоциация и удельная активность олигомеров ргалактозидаз
5.1.2. рГалактозидаза животного происхождения из печени быка.
5.1.3. рГалактозидаза бактериального происхождения из ii i
5.1.4. рГалактозидаза дрожжевого происхождения из
v ii.
5.1.5. Удельные активности олигомерных форм галактозидаз
5.2. Термоинакгивация галактозидаз различного происхождения.
5.2.1. Кинетические механизмы термоинактивации
5.2.2 Диссоциативная термоинактивация галактозидаз.
5.2.3. Индукционный период на кривых термоинактивации
галактозидаз.
5.3. Влияние различных факторов на стабильность галактозидаз
5.3.1. Активность и стабильность галактозидаз.
5.3.2. Влияние температуры на стабильность гапактозидаз.
5.3.3. Влияние катионов магния на стабильность галакгозидазы
из ii i
5.4. Термоинактивация и параметры стабильности олигомерных ферментов.
5.5. Некоторые особенности термоинактивации галакгозидазы животного происхождения из печени быка.
Глава VI. Адсорбционные слои галактозидазы из iii на
силикагеле и их стабилизация полисахаридами.
6.1. Адсорбционная иммобилизация галактозидазы
6.1.1. Адсорбция галактозидазы iii на силикагеле
6.1.2. Каталитические свойства адсорбционных слоев галактозидазы.
6.1.3. Кинетика адсорбции галактозидазы на силикагеле.
6.2. Совместные адсорбционные слои галактозидазы и
полисахаридов на поверхности силикагеля.
6.2.1 Каталитические свойства совместных адсорбционных слоев
галактозидазы и полисахаридов
6.2.2. Термостабильность адсорбционных слоев галактозидазы
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Растворимые формы нейтральной ргалактозидазы выделены из организма крысы Мг 0 , кролика . Молекулярная масса растворимого мономера по данным составляет кДа. Нейтральная Ргалактоз и даза с максимальной активностью при 6 8 была выделена из растворимой цитозольной фракции тканей печени, ночек и кишечника кролика , . Интересен фермент, выделенный из улитки 7. Данный фермент является мономером с молекулярной массой 0 5 кДа, что значительно больше других мономеров ргалактозидазы животного происхождения см. Одна из функций ргалактозидазы в организме млекопитающих гидролиз молочного сахара лактозы па два моносахарида. Изза дефицита ргалактозидазы организм многих людей иногда даже целых народов не способен усваивать молочный сахар. В то же время для ряда животных галактозидаз лактоза не является субстратом реакции. Так, например, из четырех типов галактозидаз, выделенных из различных тканей кролика, гидролиз лактозы осуществляли лишь кислая ргалактозидаза из тонкого кишечника и вм1 Ргалактозидаза, причем только в том случае, если выделена из молодых особей . Есть сведения о том, что лактозу не гидролизует также ргалакгозидаза, выделенная из печени быка . Недостаток Ргалакгозидазы в организме людей с наследственными заболеваниями центральной нервной системы ганглиозидоз, заболевание Краббе, как правило, сопровождается накоплением этих соединений . На основании проведенных исследований предполагают, что одна из функций нейтральной ргалактозидазы заключается в расщеплении лакгозилцерамидов. Недостаток этого фермента приводит к накоплению последних в печени, что наблюдается у пациетгов, больных лактозилцера. В связи с тем, что значительное количество фермента локализуется в селезенке млекопитающих, полагают, что Ргалакгозидаза участвует в фагоцитозе в процессах, связанных с разрушением мембраны эритроцитов . Галактозндазы микроорганизмов. Наиболее многочисленны и многообразны галактозидазы микроорганизмов. В соответствии с классификацией микроорганизмов ферменты также подразделяют на бактериальные, грибные и дрожжевые хотя, если быть точными, дрожжи это разновидность грибов. Бактериальные Дгалактозидазы. Бактериальные ферменты это самая многочисленная группа среди галактозидаз с известной первичной структурой, приведенной в электронных базах данных аминокислотных последовательностей. Большую часть этих ферментов относят к семейству 2 гликозилгидролаз, активность которых регулируется катионами металлов. В таблице 3 приведены некоторые характеристики бактериальных галактозидаз. К семейству 2 относят галактозидазу из ii i, в активном центре которой были обнаружены катионы магния . Подробнее структура этого фермента будет рассмотрена в разделе 1. Из антарктических бакгерий выделены два изофермента галатозидазы, один из которых гидролизует лактозу . Аминокислотная последовательность галакгозидазы, выделенной из бактерий i i, обладает высокой степенью идентичности с ферментом из . Предполагают, что оба фермента являются близкородственными и произошли от одного белкапредшествениика. Галактозидаза из i i также существует в виде активных гомотетрамеров, мономер фермента содержит аминокислотных остатка, его масса составляет 8 кДа. Молекулы многих бактериальных ферментов являются олигомерами, причем довольно большими по размеру и молекулярной массе. Например, фермент из i i 1 имеет молекулярную массу свыше 0 кД . Фермент из i Т2 с молекулярной массой 0 кДа идентифицирован как октомер . Выделена также и димерная форма данного фермента с молекулярной массой 0 кДа. В работе описаны рекомбинантные бактериальные галактозидазы, являющиеся димерами. Д. Отсутствие остатков, эквивалентных 6 и Iii8 двух из трех лигандов магния в молекуле фермента из . РГалактозидаза ii ii представляет собой димер с молекулярной массой 4 кД для нротомера . Из i i выделили три изофермента Ргалактозидазы с молекулярными массами 2, 5 и кДа. По соотношению молекулярных масс их можно идентифицировать как мономер, димер и тример. В форме гетеродимеров, обладающих активностью, существуют Ргалактозидазы, выделенные из бактерий i и i
Таблица 3.