Теломераза в клетках опухолей шейки матки : отдельные этапы регуляции

• Автор: Скворцов, Дмитрий Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

содержанием ИРА1

2.3.2 Теломеразная активность в экстрактах с пониженным содержанием ИРА

2.3.3 Влияние белка ББВ на активность теломеразы.

2.4 Проверка и адаптация ТКАРтеста для скрининга ингибиторов теломеразы

Глава 3. Материалы и методы.

3.1 Реактивы

3.3 Клинические материалы

3.4 Культивирование клеточных линий

3.5 Приготовление 0 экстрактов.

3.6 Приготовление экстрактов из образцов операционных материалов.

3.7 Приготовление Б0 клеточных экстрактов

3.8 Обработка экстрактов РНКазой А.
3.9 Получение и характеристика препарата ЯРА.
3. Иммунопреципитация ИРА
3. Всстсрнблоганализ.
3. ТЯАРтест.
3. Получение праймера ТБ, меченного Р
3. Выделение РНК из клинических материалов.
3. Агарозный гсльэлектрофорсз РНК.
3. Получение кДКОбратная транскрипция.
3. ПЦР.
Выводы.
Благодарности
Список литературы


Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотичсском спаривании хромосом и регуляции транскрипции генов прителомерной области 3, 4. В клетках, способных размножаться бесконечно бессмертных, должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В году Блскберн и Грейбсрг открыли фермент, удлиняющий теломеры теломеразу 5. Тсломераш рибонуклсопротеиновый комплекс, состоящий из молекулы РНК , белка теломеразной обратной транскриптазы v i 6 и ряда ассоциированных белков. Тсломсраза в клетках человека существует в виде димера и содержит две субъединицы обратной транскриптазы и две молекулы II 7. В теломеразе человека с связанырр шаперон, отвечающий за сборкуконформацию комплекса 33, обеспечивающий ядерную локализацию, ТР1 с неизвестной функцией. С связываются белки , i, 2, С1С2, отвечающие за стабильность, созревание и локализацию РНК , , вероятно, отвечающие за присоединение к теломерам , участвующий в процессинге, ядерной локализации I, I, ТР1 с неизвестными функциями 8. Ферментативная активность теломеразы человека в лизате ретикулоцитов кролика детектируется при добавлении и 9, . При введении в клетки, экспрессирующие , в них появляется теломеразная активность , . Заметим, что выполнение теломеразой своих функций i viv не всегда совпадает с наличием теломеразной активности, измеренной i vi с помощью основного используемого в настоящее время метода ее определения протокола амплификации теломерных повторов iii . Например, добавление гемагглютннниового эпитопа на Сконец при сохранении теломеразной активности препятствует удлинению теломер , . Активная теломераза нужна, когда клетки активно делятся. Известно, что суперэкспрессия каждого из белков р, 2, i6, р и р останавливает клеточный цикл, что сопровождается угнетением теломеразной активности в плоскоклеточиых карциномах и клеточных линиях глиомы человека , . Например. Лейкоциты человека облачают слабой теломеразной активностью. Эксперименты с остановленными в фазе лейкоцитами и последующим их стимулированием фитогемагглютинином показали, что через 2 дня более лейкоцитов переходят из 0фазы в фазу. При этом, если в экстрактах необработанных лейкоцитов в фазе тсломеразная активность не детектируется, то на первый день обработки фитогемагглютинином появляется слабая тсломеразная активность, а на второй день она возрастает более чем десятикратно по сравнению с первым. При этом оказалось, что добавление ингибитора клеточного цикла на стадии перехода в фазу не ингибирует теломеразную активность. Следовательно, детектируемая теломеразная активность появляется в лейкоцитах в фазе рис. Является ли активация теломеразы следствием входа клеток в клеточный цикл или независимым процессом точно не известно. С другой стороны i viv теломеры реплицируются во время фазы рис. В течение большей части клеточного цикла накапливается в тельцах Кахаля, в фазе совмещаясь с теломерами в клетках. Кахаля или теломерами. В фазе клеточного цикла перемещается в нуклеоли, затем в тельца Кахаля и затем на теломеры ,. Рис. Схема клеточного цикла. Появление активности теломеразы i vi происходит в фазе, а работает она в фазе. Активность теломеразы в зависимости от числа делений хорошо описывается двухшаговой гипотезой клеточного старения и обретения бессмертия иммортализации теорией М1М2 рис. В клеточных линиях эпителия теломераза активна и длина теломер поддерживается на постоянном уровне. В стволовых клетках активность теломеразы ниже и позволяет лишь частично компенсировать укорочение теломер. В соматических клетках активность теломеразы отсутствует. Укорочение теломер приводит в момент достижение предела Хайфлика точка А на рис. Клетки, преодолевшие , продолжают делиться и входят в состояние кризиса М2 точка Б на рис. Уцелевшие клетки перерождаются в опухолевые. Раковые клетки способны к неограниченному делению и поддержанию длины теломер как правило с помощью теломеразы. Если экспрессирующие не достигшие момента М2 соматические клетки трансфецировать геном точка В на рис.