Механизмы фотоиндуцированных реакций n-нитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации белков

• Автор: Аврамчук, Татьяна Витальевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Проблемы в фотоаффинной модификации биополимеров при использовании ароматических азидов в качестве функциональных групп аффинных реагентов обзор литературы
1.1. Фотоаффинная модификация, и ее место в ряду других методов исследования надмолекулярных комплексов. Типы фотоактивируемых групп. Задача обзора

1.2 Проблемы, возникающие при интерпретации результатов

экспериментов по фотоаффинной модификации биополимеров

1.2.1. Фотоактивируемые реагенты, содержащие азидогруппу в гетероциклическом основании

1.2.2. Фотоактивируемые реагенты на основе ароматических азидов

1.2.2.1. пЛ Гитрозамещнные арилазиды

1.2.2.2. Прочие арилазиды

1.2.3. Заключение

1.3. Реакционная способность продуктов фотопревращения арилазидов в

отношении функциональных групп биополимеров, или групп их имитирующих.
1.3.1. Азирины и азациклогептатстрасны
1.3.2. Аминильные радикалы и радикалы амминия
1.3.3. Катионы арилнитрения
1.3.4 Нитрозооксиды, нитрозососдинения и гидроксилами и ы
1.3.5. Илиды
1.3.6. Производные ибензохинонмоно и диимина.
1.4 Заключение
ГЛАВА 2. Результаты и их обсуждения
2.1. Долгоживущие интермедиаты ответственные за темновые процессы, протекающие при фотоаффинной модификации белков реагентами на основе 5азидо2нитробензойной кислоты
2.1.1. Синтез У5азидо2ни1робензоилЛг1биотин ил1,
диаминоэтана и У5азидо2нитробензоилУУбиотинил1,3диамииопропана
2.1.2. Связывание фотоаналогов биотина и продуктов их фотолиза с лигандсвязывающим центром субъединиц стрептавидина
2.1.3. Фотовзаимодействие и вторичные реакции фотоактивируемых аналогов биотина и с активным центром стрептавидина
2.1.4. Фотопревращения фотоаналогов биотина и при облучении в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров
2.1.4.1. Механизм фотопревращения фотоаналога биотина
2.1.5. Механизм фотопревращения янитрозамещенных арилазидов в условиях проведения фотоаффинной модификации биополимеров
2.1.5.1. Фотопревращения Л5азидо2нитробензоил1,3диаминопропана при облучении в водных растворах
2.1.5.2. Фотопревращение 4нитрофенилазида при облучении в водных растворах
2.2. Изучение продуктов фотовзаимодействия 5азидо2нитробензоильных реагентов с аминокислотными остатками в условиях сближения реакционных центров
2.2.1. Анализ модифицированных пептидов.
2.2.2. Фотоиндуцнрованное взаимодействие 5азидо2нитробензоильной группы с функциональными группами , i и
2.2.2.1. Синтез 5азидо.А2ЗНимидазол4илэтил2нитробензамида 4 и 2амино3Ниндол3илпропиониламинопропил5азидо2нитробензамида
2.2.2.2. Фотолиз 5азидоУ2ЗНимидазол4илэтил2нитробензамида
2.2.2.3. Фотолиз Аамино3Ниндол3илпропиониламинопропил 5азидо2нитробензамида
2.2.2.4. Сравнительный анализ результатов по фотовзаимодействию 5азидо2нитробензоильной группы с функциональнымигруппами , i, и Туг
ГЛАВА 3. Экспериментальная часть
3.1. екрквы
3.2. Методы
3.3. Вычисление квантового выхода фотолиза соединений и
3.4. Ступенчатый фотолиз соединений и
3.5. Исследование соотношения продуктов фотолиза 7У2нитро5азидобензоил1,3диамйнопропана 5азидоЗНимидазол4илэтил2нитробензамида 4 и 2аминоНиндол3илпропиониламинопропил5азидо2нитробензамида 5 в зависимости от содержания кислорода в облучаемом растворе
3.6. Исследование взаимодействия продуктов фотолиза 4нитрофенилазида 4 с 4нитронитрозобензолом
3.7. Получение свободных оснований У2нитро5азидобензоил1,2
диаминоэтана и 2нитро5азидобензоил1,3диаминопропана
из соответствующих хлоргидратов
3.8. Идентификация продуктов фотолиза Л5азидо2нитробензоил1,3
диаминопропана
3.9. Синтез У2ннтро5азидобензоклс1биотинил1,2диаминоэтана
и АнитроЗазидобензоилЭТГбиотинилЭПЗдиаминопропана
3 Идентификация продуктов фотолиза Лг2нитро5азидобензоилУб
ц биотинил1,2диаминоэтана
3 Синтез 5азидоДГ2ЗНимидазол4илэтил2нитробензамида 4
3 Идентификация продуктов фотолиза 4
3 Синтез гаминоНи1Щол3илпропиониламинопропил5
азидо2нитробензамида
3 Идентификация продуктов фотолиза арилазида 5
3 Взаимодействие предоблучнных фотоаналогов биотина и со
стрептавидином и стрептавидинбиотиновым комплексом
3 .Фотомодификация стрептавидина фотоаналогами биотина на и
3 Ферментативный гидролиз фотомодифицированного стрептавидина
3 Анализ последовательности фотомодифицированных пептидов
9 ВЫВОДЫ из
ПРИМЕЧАНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, с помощью этого метода вряд ли возможно идентифицировать весь спектр аминокислотных остатков, находящихся в области контакта с субстратом лигандом. Проведение фотоаффинной модификации подразумевает использование реагентов, состоящих из двух частей адресной части, имеющей сродство к какомулибо компоненту биологического комплекса, и фотоактивирусмой части, осуществляющей взаимодействие с мишенью 5,. Аффинная часть фотоаффннного реагента обеспечивает установление обратимого равновесия между свободным и связанным в комплексе фотоалигандом. В конечном итоге модифицированный фермент исследуется набором методов спектрофотометрический анализ , электрофоретический анализ , флуорофорная методика , гидролиз с последующим применением хроматографического анализа и массспсктромстрии . Использование ряда реагентов, содержащих фотоактивируемую группу, связанную с лигандом линкерами разной длины позволяет получать информацию не только о топографии центра специфического связывания лигандов, но и исследовать удаленность того или иного компонента надмолекулярного комплекса от аффинной части реагента . Основное преимущество применения фотоаффинных реагентов в сравнении с другими типами аффинных реагентов алкилирующими, ацилирующими, арилирующими, фосфорилирующими и т. Это упрощает в большинстве случаев интерпретацию полученных данных. Кроме того, возможно варьирование скорости фотохимической реакции путем изменения мощности облучения при этом не меняется или меняется незначительно химический состав реакционной смеси, что также удобно при постановке экспериментов. Сама активация фоточувствителыюй группы может быть осуществлена за очень короткое время, что открывает возможность исследования динамики процессов, происходящих при взаимодействии биологических макромолекул. В качестве фотоактивируемых соединений наиболее распространены арилазиды, диазосоединения 5,,, диазирины, сульфиды, кетосоединения 5. Описаны так же случаи применения сульфонов Баденозилметионин был использован для фотомодификации метилтрансферазы и галогензамещнных арилов . Фотоактивации подвержены и некоторые хромофоры, присутствующие в природных макромолекулах азотистые основания, ароматические и серусодержащие аминокислоты 5. Среди всей выборки фотоактивируемых групп, перспективность применения арилазидов обусловлена их спектральными, а иногда и фотохимическими свойствами. Облучение многих соединений не азидной природы диазосоединения, диазирины, бензофеноны, ароматические нитросоединения приводит к хорошему квантовому выходу только при длинах волн, губительных для биологических макромолекул 4 0 нм . В работе показано, что при облучении фермента светом с длинной волны 4 нм происходит потеря активности. Авторы работы показали, что при облучении в течение 5 ч альбумина светом с длиной волны 0 нм разрушается остатков цистсина. В этой же работе продемонстрировано, что фотолабильными так же являются такие аминокислоты как , Туг, Тгр, при этом в кислой среде фотолиз оказывает более разрушительное воздействие. Фотолиз некоторых арилазидов так же проводится при 4 нм, но при этом общее количество энергии, требуемое для активации азидогруппы существенно меньше количества, требуемого для активации других типов фотоактивируемых групп . Некоторые широко используемые арилазидные группы активируются при облучении светом с диной волны 3 5 нм гораздо эффективнее, чем другие фотоактивируемые остатки, используемые в фотоаффинной модификации. Арилазиды, по сравнению с карбенгенерирующими соединениями диазирины, диазосоединения, при фотолизе в гораздо меньшей степени реагируют с водой . Такие фотоактивируемые источники карборадикалов, как бензофеноны при фотолизе даже менее реакционноспособны в отношении воды, чем арилазиды, но они слишком избирательны в отношении модифицируемых мишеней . Несмотря на перспективность применения ароматических азидов в качестве функциональных групп фотоаффинных реагентов, существует ряд проблем, создающих сложности при интерпретации результатов эксперимента.