Ca2+/рековерин-зависимая регуляция фототрансдукции

• Автор: Сенин, Иван Иванович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 239 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая схема фототрансдукции.

1.1. Строение глаза, сетчатки и фоторецепторных клеток.

1.2. Морфология и состав наружных сегментов палочек

1.3. Передача зрительного сигнала

1.4. Восстановление темпового состояния

2. Родопсинкиназа

2.1. Ген и тканевая локализация родопсинкиназы.

2.2. Характеристика доменов родопсинкиназы и посггрансляционные модификации

2.3. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и се активация

2.4. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой
2.5. Фосфорилирование родопсина с высоким выходом
3. Молекулярные механизмы Са2зависимой регуляции фототрансдукции
3.1. Светозависимое изменение концентрации кальция в НСГ
3.2. Ионы кальция и гуанилатциклаза.
3.3. Ионы кальция и адснилатциклаза
4. Белки семейства нейрональных Са сенсоров
4.1. Общая характеристика семейства нейрональных Са2 сенсоров
4.2. Рековерин.
4.2.1. Тканевая и клеточная локализация
4.2.2. Ген и первичная структура.
4.2.3. ТФконцсвое ацилирование.
4.2.4. Са2связывающие центры рековерина
4.2.5. Пространственная структура и модель Са миристоильного переключателя.
4.3. вСДРбелки.
4.4. Визининподобные белки
4.5. Фреквенины.
4.6. КСЫРбелки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Действие рековерина в реакции фосфорилирования фаговозбужденного родопсина, катализируемой родопсинкиназой
1.1. Изучение влияния кальция на фосфорилирование родопсина в суспензии НСП.
1.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование родопсина в реконструированной системе
1.3. Изучение роли Мконцевого миристоилирования рековерина на его физикохимические и функциональные свойства.
1.3.1. Получение миристоилированной и немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина
1.3.2. Влияние Мконцевого миристоилирования рековерина на его эффективность как ингибитора родопсинкиназы.
1.4. Влияние содержания холестерина фоторецеторных мембран на взаимодействие рековерина с фотореценторнымимембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина
1.4.1. Исследование влияния холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами
1.4.2. Влияние содержания холестерина на Са2рековерин зависимую регуляцию фосфорилирования родопсина
1.5. Сравнение влияния рековерина на фосфорилирование темпового и фотовозбужденного родопсина.
1.5.1. Определение соотношения фосфородопсинфосфоопсии при различных уровнях обесцвечивания родопсина
1.5.2. Сравнение ингибирующей эффективности рековсрина в реакции фосфорилирования темпового и фотовозбужденного родопсина в реконструированной системе.
1.5.3. Сравнение ингибирующей эффективности рековерина в реакциях фосфорилирования темнового и фотовозбужденного родопсина в суспензии НСП.
1.6. Изучение механизма Сарековсрин зависимой регуляции родопсин киназы.
1.6.1. Выявление участков родопсиикиназы, вовлеченных во взаимодействие с рековерином
1.6.2. Изучение влияния рековсрина на процесс фосфорилирования свстоактивированиого родопсина, катализируемый родопсинкиназойЮ
1.6.2.1. Изучение влияния рековерина на образование комплекса между светоактивированным родопсином и родонсинкиназой
1.6.2.2. Изучение влияния рековерина на фосфорилирование Сконцевого пептидного фрагмента родопсина
1.6.2.3. Изучение функциональных свойств рековсринсвязывающсго
участка родопсиикиназы
ВЫВОДЫ глава
2. Изучение механизма Са2миристоилыюго переключателя на примере рековерина
2.1. Исследование механизма связывания ионов кальция с рековерином.
2.2. Изучение роли Са2связывающих центров рековерина в функционировании его Са2миристоильного переключателя
2.2.1. Кальцийзависимое экспонирование гидрофобного кармана рековерина
2.2.2. Кальцийзависимое ингибирование родопсиикиназы рековерином.
2.2.3. Кальцийзависимое экспонирование миристоильного остатка рековерина
2.2.4. Исследование взаимодействия рековсрина дикого типа и его мутантов по кальцийсвязывающим центрам с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии
2.2.4.1. Характеристика метода спсктроскогши применительно к связыванию рековсрина с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе
2.2.4.2. Определение сродства миристоилированных форм рековерина и мутанта 8 к липидному бислою, иммобилизованному на чипе
2.2.4.3. Исследование кальцийзависимого экспонирования миристоильного остатка рсковерина методом спектроскопии.
2.2.4.4. Кинетика диссоциации миристоилированных форм рековерина и мутанта из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе.
2.3. Структурные предпосылки механизма Са2 миристоильного переключателя обсуждение результатов главы
ВЫВОДЫ глава
3. Исследование функциональных свойств рсковерина, содержащего реконструированный 4 Са2тсвязывающий центр 4.
3.1. Связывание ионов кальция мутантами рсковерина, модифицированными по четвертому Са2связывающему центру
3.2. Са2зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2связывающему центру, с фоторецепторными мембранами.
3.3. Са зависимое ингибирование родопсинкиназы мутантами рсковерина, модифицированными по четвертому Са2связывающему центру
3.4. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом спектроскопии.
3.4.1. Применимость метода спектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековсрина 4 с иммобилизованным липидным бислоем.
3.4.2. Кинетика диссоциации мутантов 4, и из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на чипе
ВЫВОД глава
4. Са2рековерин зависимая регуляция фототрансдукции и патологии зрения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Выделение НСГ
3. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран.
4. Получение рекомбинантного миристоилированного и немиристоилированного рековерина.
5. Очистка препарата миристоилированного рековсрина от примеси немиристоилированного
6. Приготовление кальциевых буферов и измерение
7. Определение количества кальция, связанного с рековерином
8. Взаимодействие рековсрина с фенилсефарозой
9. Выделение родопсинкиназы
. Определение активности родопсинкиназы
. Связывание рековерина с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами.
. спектроскопия
.1. Приготовление липосом
.2. Иммобилизация липосом
.3. Измерение связывания рековерина с ЗРЯчипом и обработка экспериментальных данных
. Получение химерных белков 1 и Сконцевых доменов родопсинкиназы и рекомбинантного белка глутатион 8трансферазы
. Аналитические процедуры.
.1. Определение концентрации белков.
.2. ЭОЗэлектрофорез в полиакриламидном 1еле ПААГ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет как бы ведег свое происхождение от внеклеточного пространства заметим, что наружные сегменты колбочек по своему строению принципиально отличаются от НСП тем, что колбочковые диски представляют собой складки плазматической мембраны и их внутреннее пространство сообщается с внеклеточной средой 1, 2. Диски расположены друг над другом стопкой и их края имеют разрезы, или инциссуры, направленные от периферии к центру, которые придают дискам дольчатый вид. Разрезы образуют как бы желобки, идущие вдоль НСП, и в этих желобках помещаются микротрубочки, берущие начало в аксонсме у основания наружного сегмента. Подавляющая часть мембран НСП это мембраны фоторецепторных дисков, на плазматическую мембрану приходится всего лишь общей массы мембран НСП 5, 6. НСП человека их содержится около , быка 0, лягушки . Фоторецепторные клетки, будучи нейронами, подчиняются известному правилу, гласящему, что нервные клетки не восстанавливаются. Однако ото правило не распространяется на палочковые диски, которые в течение всей жизни палочки претерпевают непрерывное обновление, происходящее следующим образом. По мере образования у основания НСП и отпочковывания от плазматической мембраны фоторецепторные диски постепенно перемещаются в направлении верхушки сегмента. Одновременно на их место приходят новые диски, поступающие со стороны цилии. В конечном счете старые диски отшелушиваются с конца НСП, фагоцитируются клетками пигментного эпителия, после чего деградируют под действием его лизосомальной системы. Процесс обновления фоторецепторных дисков происходит непрерывно и с высокой скоростью. Так, у лягушек ежедневно обновляется до дисков на НСП 1. Состав НСП также необычен. Фоторецепторные диски главный структурный элемент СП построены почти исключительно из белков и липидов около и общей массы мембран соответственно. Углеводов в НСП немного лишь 4 их общего сухого веса. В цитоплазме НСП, заполняющей узкие просветы между дисковыми мембранами и зазоры между внешними краями дисков и плазматической мембраной, главный компонент это белки 1,3. Липидный состав фоторецепторных мембран характеризуется малым количеством холестерина и большим содержанием двойных связей, что в совокупности обусловливает низкую вязкость и высокую лабильность этих мембран. Тем не менее их состав даже болсс консервативен, чем у менее текучих биологических мембран из некоторых жизненно важных органов. Белковый состав ПСП уникален. В зависимости от поведения белков в гипотонической среде в растворе с концентрацией соли около мМ они разделяются на интегральные мембранные и экстрагируемые. Интегральные мембранные белки ПСП остаются в связанном с мембранами состоянии даже после их интенсивной экстракции. Таких белков около общего количества белков в НСГ1, причем их основная доля около приходится на зрительный пигмент родопсин 7. Экстрагируемые белки ПСП проигрывают интегральным мембранным белкам по общей массе, зато они намного богаче по номенклатуре первых в НСП порядка типов, вторых, включая родопсин, немногим более . Больше всего в экстрагируемой фракции белка траисдуцина, количество которого примерно в раз меньше по сравнению с родопсином. Далее следует белок аррестин его в НСП в несколько раз меньше, чем траисдуцина. Еще несколько белков представлено в 0 раз меньшем количестве, чем трансдуцин. Среди них функционально наиболее важные фосфодиэстераза циклического фосфодиэстсраза, родопсинкиназа, гуанилилциклаза, трансдуцин. Молярное соотношение фосфодиэстераза трансдуцин родопсин выглядит как 1 0 8. Именно интегральный мембранный рецептор родопсин и названные выше экстрагируемые белки служат компонентами молекулярной машины, обеспечивающей в НСП, которые выполняют функции световой антенны, т. Свет, воздействуя на зрительный пигмент родопсин, переводит его в фотовозбужденное состояние , и далее сигнал передастся от к зависимым катионным каналам, локализованным в плазматической мембране фоторецепторной клетки.