Разработка эффективного способа получения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения штамм-продуцента E.coli

• Автор: Гусарова, Валентина Дмитриевна
• Шифр специальности: 02.00.10, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.Образование тел включения

1.1 .Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в

бактериальных клетках

1.2. Выделение тел включения.

1.3. Растворение тел включения.

1.4. Очистка растворенных белков тел включения.

2. Ренатурация белков тел включения

2.1. Удаление денатуранта
2.2. Хроматографическая ренатурация
2.2.1 .Эксклюзионная хроматография.
2.2.2. Адсорбционная ренатурация.
2.2.3. Ренатурация с иммобилизированными катализаторами фолдингаЗ
2.3. Ренатурация белков с дисульфидными связями
2.4. Влияние физических факторов на ренатурацию
2.5. Ренатурация с низкомолекулярными добавками
2.6. Ренатурация, имитирующая процесс i viv
2.6.1. Природные шапероны
2.6.2. Мицеллярные системы.
2.6.3. Жидкий парафин как псевдолипидний бислой
3. Получение генноинжеиериог инсулина человека из ТВ .i
3.1. Методы получения рекомбинантных блков проинсулина.
3.2. Фолдинг рекомбинантных белков проинсулина.
3.2.1. Восстановление
3.2.2. Сульфитолиз.
3.2.3. Метод минипроинсулина
ОБСУЖДЕНИЕ И РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Постановка задачи.
2. Разработка внутрипроизводственного контроля содержания мономера РБ в растворах
2.1. Получение стандартного образца мономера РБ.
2.2. Подбор условий аналитического разделения мономера РБ и его мультимерных форм.
2.2.1. Подвижная фаза
2.2.2. Определение оптимальной скорости элюции.
2.3. Валидация метода анализа
2.3.1. Линейность определения концентрации РБ
2.3.2. Правильность и точность.
2.3.3.Предел обнаружения и предел количественной оценки
2.3.4.Специфичност ь.
2.3.5.Устойчивость метода
2.4. Выводы.
3. Денатурация РБ
3.1. Денатурация РБ влияние хаотропного агента.
3.2. Денатурация РБ и буферная система
1 3.3. Денатурация РБ концентрация восстанавливающего агента и
концентрация РБ.
4. Ренату рация восстановленного РБ
4.1. Ренатурация РБ определение максимального выхода.
4.2.Ренатурация РБ влияние внешних факторов
4.3. Ренатурация РБ концентрация РБ
4.4. Ренатурация РБ низкомолекулярные добавки
4.5. Ренатурация РБ окислительновосстановительные пары
5. Масштабирование результатов до препаративного уровня
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ПРИБОРЫ
1. Материалы.
1.1. Реактивы.
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны.
2. Приборы
2.1. Хроматографические системы
2.2. Оборудование
3. Методы.
3.1. Контроль содержания мономера РБ методом .
3.2. Получение рабочего стандарта РБ.
3.2.1. Выделение РБ из ТВ.
3.2.2.Проведение ионообменной очистки.
3.2.3.Провсдение ВЭЖХочистки.
3.3. Валидация анализа рекомбинантного белка.
3.3.1. Линейность определения концентрации РБ.
3.3.2. Правильность и точность
3.3.3. Специфичность
3.3.4. Устойчивость метода
4. Оптимизация денатурациивосстановления РБ
4.1. Влияние хаотропного агента
4.2. Влияние среды и буферного агента.
4.3. Влияние концентрации восстанавливающего агента и РБ.
5. Оптимизация ренагурации восстановленною РБ.
5.1. Определение максимального выхода ренатурации
5.2. Определение влияния внешних факторов на ренатурацию.
5.3. Определение влияния концентрации РБ на ренатурацию
5.4. Влияние низкомолекулярных добавок.
5.5. Влияние окислительновосстановительных пар
6. Масштабирование результатов до препаративного уровня.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
БИБЛИОГРАФИЯ


Длительное время с момента открытия в году инсулин получали, в основном, экстракцией из поджелудочных желез животных. Такой подход сдерживал развитие терапии диабета, поскольку из одной поджелудочной железы свиньи можно выделить 0 мг этою г ормона. Поскольку молекулы инсулина свиней и человека различаются только одним аминокислотным остатком АаТг в положении ВЗО рис. Значительный прогресс к производстве инсулина, как и других терапевтических белков, был достигнут с применением генноинженерных методов для создания соответствующих трансгеиных микроорганизмов. Главный успех генной инженерии заключается в разработке бактериальных экспрессионных систем, в частности на основе штаммпродуцента . ДНК 6, 7. Как правило, запас большинства белков, имеющих потенциальное клиническое или промышленное значение, ограничивается их малой природной доступностью. В свете этого кажется очевидным использование данной технологии как гаранта неограниченного запаса рекомбинантных белков. Так в е годы XX века американской компанией разработана технология производства генноинженерного инсулина человека ГИЧ, которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией i i 8. США, ivi ГерманияФранция, v i Дания. В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. Л.Овчинникова Российской академии наук ИБХ РАН при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина. В настоящее время предпринимаются попытки повысить эффективнос ть процесса получения инсулина, однако высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка в . РВ, но и ряд бактсришшшх балластных белков. Поэтому для получения целевого компонента в нативном виде требуются определенные шаги для растворения таких агрегатов, выделения из них белка и его ренатурации. Способы проведения этих процедур во многом определяют специфику всего производства биофармацевтических белков и имеют существенное влияние на производственные затраты. Основной цслыо данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения рекомбинантного белка проинсулина человека из тел включения . В соответствии е поставленной . Разработать и валидировать метод контроля содержания мономера РБ в растворах. Изучить и оптимизировать процесс денатурации рекомбинантного белка из ТВ. Определить концентрацию восстанавливающего аген та и концентрацию РБ. Исследовать и оптимизировать процесс ренату рации восстановленного РЬ. Масш табировать полученные результаты от аналитического до препаративного уровня. Главный успех генной инженерии заключается в разработке бактериальных экспрессионных систем, в частности на основе штаммпродуцента . Например, технология рекомбинантных ДНК к настоящему времени обеспечивает эффективное производство таких терапевтических белков, как и нсулин , гормона роста и интерферона 1 . Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основные механизма комиартментализация продуктов трансляции, белокбелковые взаимодействия и посс трансляционные модификации. Образующиеся в эндоплазматическом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посстрансляционные модификации. При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Гак, молекулы инсулина накапливаются i viv в секреторных гранулах, в которых составляет 4. В этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Посттрансляциоиные модификации белков, в частности фосфорилирование, гидроксилированис, гликозилирование и частичный протсолиз, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток, также оказывают большое влияние на растворимость белков, их стабильность и биологические функции.