Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома P450scc (CYP11A1) в гетерологических системах

• Автор: Миненко, Андрей Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Основы импорта белков в митохондрии

1.2 Траислоказа внешней мембраны П ОМ комплекс

1.2.1 Рецепторы ТОМкомпяекса,

1.2.2 Центральный транспортный канал.

1.3 комплекс

1.4 Импорт небольших белков межмембранного пространства.

1.5 Траислоказа встраивания Т1Мкомплекс

1.6 Траислоказа переноса ПК3комплекс.
1.6.1 РАМко мплекс
1.7 Встраивание предшественников во внутреннюю мембрану.
1.8 Митохондриальная процессирующая пептидаза.
1.9 Сигналы митохондриального импорта.
1. Общая характеристика цитохрома 1
1. Механизм действия холест еринл юн о оке иге н азнойОшазной системы
1. Топогенсз и топология А1 в мембране
1. Взаимодействие 1 с адрсиодоксинол
1. Узнавание субстрата и канал доступа.
1. Активный центр 11
1. Импорт I11 в гетерологическиемитохондрии
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ4
2.1 Материалы.
2.1.1 Реактивы к ферменты
2.1.2 Использованные клеточные штаммы и тазмиды
2.2 Методы
2.2.1 Методы работы с ДНК
2.2.2 Выделение ДНК
2.2.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.
2.2.4 Выделение аналитических количеств пзагиидной ДНК мини щелочной метод.
2.2.5 Рестрикпшый анализ.
2.2. б Препаративная рестрикция пл азмидной ДНК
2.2.7 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.8 IМодификация концевых участков ДНК.
2.2.9 Проведение полимеразной цепной реакции.
2.2. Лигирование.4
2.2. Секвенирование.
2.2. 2 Методы работы с клетками . i.
2.2. 3 Условия роста штаммов . i
2.2. Экспрессия рекомбинантных белков с клетках . i.
2.2. Трансформация клеток . i с применением .
2.2. Трансформация клеток . i методом электропорации
2.2. Фракционирование клеток . i с использованием
2.2. I Получение спектров рекомбинантных белков.
2.2. Методы работы с клетками . vii.
2.2. Условия роста штаммов . vii
2.2. Трансформация клеток . vii.
2.2. Выделение митохондрий из дрожжевых к сток.
2.2. Определение содержания белка по Лоури
2.2. Электрофорез по Лэммли.
2.2. Пл сиунобяоттинг.
2.2. Щелочная экстракция митохондриальных белков
2.2. Озвучивание митохондий в .
2.2. Получение митопчастов
2.2. Обработка митохондрий и митопяастов протсиназой К
2.2. Трипе шюяиз
2.2. Определение ферментативной активнос ти рекомбинантных белков.
2.3 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков ЛАС 1А1,
А I и 1А1 в дрожжевых клетках
2.4 Конструирование плазмиды А1 для экспресии гибридного
белка Л1 в дрожэсевых клетках
2.5 Конструирование плазмид для экспресии гибридных белков 9 2
IА1 и 1А1 в бактериальных клетках
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.6 Постановка задачи.
2.7 Экспрессия гибридных белков.
2. Определение виутримитохондриальиои локализации гибридных белков
2.8. Карбонатная экстракции митохондриальных белков
2.8.2 Определение внушрнмитохондршыьноп локализации гибридных белков.
2.9 Каталитическая активность гибридных белков в митохондриях.
2. Характеристика СУР А1 домена в составе гибрида АЛ 1А1.
2. Экспрессия гибридных белков в бактериальных клетках,
2. Экспрессия гибридных белков ргеАстСУР А1 и Сох1У1тСУРА1 в штаммах УРН9и УРН9ратЛ
2. Закию чение.
3 ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Закию чение. ВЫВОДЫ. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ. Ас. НЕРЕБ Ы2гидроксиэтилпипсразинЫ2этансул. ВВЕДЕНИЕ. В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении топогенеза митохондриальных белков, синтезируемых как в цитозоле, так и в самих органеллах. Детально изучен транслокационный аппарат митохондрий белковые транслоконы ТОМ, Т1М, Т1М, механизмы прохождения импортируемых полипептидных цепей через митохондриальные мембраны. Установлены общие принципы импорта белковых предшественников в митохондрии, их распределение по субмитохондриальным компартментам хотя и для достаточно ограниченного числа традиционных белковмоделей. Вместе с тем. В частности, это касается механизмов встраивания белков в митохондриальные мембраны и, особенно, во внутреннюю мембрану, в которой сосредоточены компоненты, отвечающие за эксклюзивные функции митохондрий. Особый интерес представляет включение в митохондриальные мембраны белков, не имеющих отчетливо выраженных топогсиных сигналов. К числу таких белков относится цитохром Р0ясс СУРА1. КАИРН адренодоксиноксндорсдукгазой, за ключевую стадию синтеза всех стероидных гормонов млекопитающих превращение холестерина в прегненолон. Особенностью СУРАI как субстрата для импорта является так же то, что он является гемпротеином и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гсм. Изучение топогенеза митохондриального цитохрома СУРА1, который в силу отсутствия характерных топогенных сигналов не может встраиваться в мембрану ни по одному из охарактеризованных к настоящему моменту молекулярных механизмов, должно способствовать расширению современных представлений о митохондриальном белковом импорте. Основы импорта белков в митохондрии. В дрожжах только восемь, а у человека только митохондриальных белков кодируется в геноме органеллы и синтезируется в матриксе. Более митохондриальных белков кодируется ядерными нами и синтезируются как белковые предшественники на цитоплазматических рибосомах. Различают два основных класса предшественников, принципиально отличающихся по типу используемых сигналов импорта в митохондрию 2. К первом классу относят предшественники матриксных белков, содержащих на концс отщепляемую аминокислотную прспоследовательность. Большинство представителей второго класса белков многочисленные переносчики метаболитов, локализованные во внутренней мембране митохондрии и содержащие от трех до шести гидрофобных доменов 3. Препоследовательность содержит положительно заряженные гидрофобные и гидроксилнрованмые аминокислотные остатки. Характерной чертой нрепоследовательности является способность образовывать амфифильную аспираль, которая представляет1 собой положительно заряженную поверхность с одной стороны и гидрофобную поверхность с другой стороны 4, 5. Кроме этих основных классов, существуют несколько специфических типов предшественников для белков внешней и внутренней мембран и белков межмембранного пространства. Основой для специфического распознавания и переноса предшественников через внешнюю мембрану митохондрий является комплекс мембранных белков ТОМ. Трапслоказа внешней мембраны ТОМ комплекс от англ. I от англ. Рис. Основные пути импорта белков в митохондрии. В дальнейшем предшественники, которые состоят из 3листов и имеют бочкообразную третичную структуру, встраиваются во внешнюю мембрану, как было недавно обнаружено 7, посредством комплекса от англ. Для импорта некоторых белков, имеющих специфические цистеиновые мотивы, необходимы белки i и v 8. Внутренняя мембрана содержит два транслокационных комплекса I и Т1Мкомплексы от англ. I посредник во встраивании во внутреннюю мембрану гидрофобных белковпереносчиков метаболитов 9. I транспортирует предшественники с отщепляемой препоследовательностью. При этом предшественники переносятся в матрикс митохондрий при взаимодействии комплексов I и РАМ от англ. РАМ диссоциирован от I 4. Как правило, в последнем случае импортируемые белки содержат трансмембранный домен, расположенный вблизи от сигнальной препоследовательности.