Взаимодействие тмРНК с рибосомой в процессе транс-трансляции

• Автор: Бугаева, Елизавета Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

Содержание
Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Общие сведения о тмРНК

Вторичная структура тмРНК

Процессинг тмРНК

Модификация оснований тмРНК

Аминоацилирование тмРНК

Белок
Общие сведения о
Пространственная организация
Взаимодействие белка с тмРНК
Взаимодействие и тмРНК с рибосомой
7дстрансляция
Модель процесса тршстрансляции
Причины появления свободного А сайта в транслирующих рибосомах
Распознавание арестованных рибосом и свободного А сайта
Переключение на матричную область, узнавание кодона продолжения синтеза
Элонгация и терминация
Деградация белка и мРНК
Биологическая роль транстрансляции
Материалы и методы
Реактивы и биопрепараты
Буферы и растворы
Трансформация клеток ii i
Приготовление компетентных клеток ii i для трансформации с помощью
теплового шока
Трансформация с помощью теплового шока
Введение мутаций в ген, кодирующий тмРНК. Сайгнаправленный мутагенез Анализ активности мутантных молекул тмРНК с помощью генетической системы
Выделение комплекса тмРНК с рибосомой
Выделение суммарной РНК комплекса
Окрашивание ПААТ
Выделение суммарного белка комплекса
Окрашивание ПАЛИБОБ Кумасси 0
Массспсктрометрический анализ белков
Диализ
УФсшивание тмРНК с рибосомой
Приготовление зонда для гибридизации с тмРНК
Нозернблот анализ
Переосаждение антител
Определение концентрации белка по методу Брэдфорда
Вестсрнблот анализ
Выделение мутантных тмРНК
Химический пробинг
Криоэлсктронная томография
Компьютерное моделирование
Результаты и обсуждение
Выделение комплексов грансиортноматричной РНК с рибосомой
Анализ РНК, входящих в состав выделенных комплексов
Анализ белкового состава выделенных комплексов
Исследование комплекса тмРНК с рибосомой методом ковалентного сшивания Исследование комплексов тмРНК с рибосомой методом химического пробимга Исследование комплекса гмРНК с рибосомой методом криозлектрониой томографии
Компьютерное моделирование процесса прохождения тмРНК через рибосому в ходе тралстрансляции
Выводы
Список литературы


Гены, кодирующие тмРНК , от англ. А малая стабильная РМК А, были найдены во всех бактериальных геномах, последовательность которых определена к настоящему моменту. Ген тмРНК был также идентифицирован в геноме некоторых органелл в цианелле из x и в хлоропластах из , , ii и ii iii . Гены, кодирующие тмРНК гомологи, были обнаружены в митохондриальном геноме из i i 4. Некоторые исследователи полагают, что тмРНКподобные молекулы, у которых, однако, отсутствует мРНКподобная часть, обнаруженные в митохондриальном геноме хохлатого голубя, могут обладать и тмРНКиодобными функциями 5. Генов, подобных , в геномах архсобактерий и эукариотических организмов найдено не было 4. Косвенным подтверждением важности тмРНК для бактериальной клетки является факт присутствия сс гена в геноме ii 6, наименьшем из всех известных бактериальных геномов. В клетках . Ген тмРНК моноцистрониый, имеет собственный промотор и герминатор 8, па котором осуществляется независимая терминация 6. Размер бактериальных тмРНК варьирует от 0 до 0 нуклеотидов . Длина тмРНК в . Все тмРНК имеют сходную структуру, состоящую из тРНКподобной части, нескольких от 1 до 4 псевдоузлов и одноцепочечного района 4. Функциональная тмРНК обычно представлена одной молекулой, но может состоять и из двух фрагментов РНК, как в случае 4. В обычных условиях в . РИК, что соответствует одной молекуле тмРНК на рибосом 1,9. РНК превышает время удвоения бактерий . Однако стабильность тмРНК зависит от присутствия достаточного количества белка . Уменьшение числа молекул белка от на клетку до 0 приводит к увеличению скорости деградации тмРНК . Изза деградации уровень тмРНК в клетках . РНК ,. В соотношение уровня транскрипции и деградации тмРНК зависит от стадии клеточного цикла. Исследователи обнаружили молекул тмРНК на клетку перед стадией репликации, однако после репликации уровень тмРНК резко падает . Ранние исследования, проведенные с использованием клеток . ДллгЛ или повреждение гена тмРНК не легальны для клеток, но замедляют их рост в условиях физического повышенная температура или химического углеродное голодание стресса. Ген необходим для клеточного роста. Мутантный штамм, в котором хромосомный ген тмРНК был инактивирован вставкой гена хлорамфениколацетилтрансферазы, растет медленнее, чем исходный штамм. После часов инкубации мутантного штамма при С колонии не достигли размера достаточного, чтобы их измерить . Существенное различие между штаммами с нормальным и инактивированным геном проявилось в их способности восстанавливаться после углеродного голодания. Штамм, содержащий прерванный ген . А, восстанавливался после углеродного голодания медленнее, чем ш тамм дикого типа . Особенно важна тмРНК для роста клеток при повышенной температуре. Штамм с удаленным геном тмРНК при С и С рос медленнее, чем штамм дикого типа, а при С его рост прак тически прекращался . Важнейшей функцией тмРНК является участие в процессе мтснстрансляции. Трайстрансляция процесс переключения синтеза пептида с мРНК на матричную часть тмРНК. Более подробно данный процесс будет рассмотрен позднее в разделе 7шстрансляцня см. Модель структуры тмРНК была предложена на основании результатов сравнительного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей тмРНК из ти различных организмов и данных, полученных при помощи химического и энзиматического пробинга Рис. Рис. Модель вторичной структуры транспортноматричной РНК . Направление цепи обозначено от 5 к 3 концу молекулы. Звездочкой отмечено начало транслируемого района в тмРНК, черный треугольник стопкодон в рамке считывания. Последовательность кодируемого тмРНК пептида записана с помощью однобуквенного аминокислотного кода. К1рК4 псевдоузлы. В модели вторичной структуры тмРНК можно выделить три района. Первый район включает 3 и 5 концы молекулы и образует тРНКподобную структуру , от i i, состоящую из аминоакцепторного стебля и ТРСшпильки. Второй район представляет собой одноцепочечный участок , от i i, кодирующий пептид сигнальный пептид, узнаваемый протеазами.