Обнаружение и структурно-функциональная характеристика пролин- и глутаминспецифичных пептидаз из Tenebrio molitor

• Автор: Гоптарь, Ирина Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение

Список сокращений

1. Пролинспецифичные пептидазы Обзор литературы

1.1. Краткая характеристика пролинспецифичных пептидаз

1.2. Пролил олигопептидазы

1.3. Дипептиди л пептидазы IV

1.4. Дипептидилпептидазы II

1.5. Пролилкарбоксипептидазы

1.6. Пролилэпдоиеитидаза из i i

1.7. Пролилиминопептидазы

1.8. Аминопсптидазы Р
1.9. Пролидазы
1 Пролиназы цитозольные нсспецифические дипептидазы
1 Карбоксипептидазы Р
1 Заключение
2. Обсуждение результатов
2.1. Выявление и общая характеристика пролинспецифичных пептидаз
из Т. i
2.1.1. Выявление
2.1.2. Характеристика выявленных
2.1.2.1. Пептидаза
2.1.2.2. Пептидаза Рер2
2.1.2.3. Пептидаза РерЗ
2.1.2.4. Пептидаза Рер4
2.1.3. Изучение пептидазы Рер4
2.1.3.1. Очистка пептидазы Рср4
2.1.3.2. Электрофоретическое исследование очищенного препарата
пептидазы Рер4
2.1.3.3. Определение первичной структуры пептидазы Рер4
2.1.3.4. Субстратная специфичность пептидазы Рср4
2.1.3.5. Ингибирование Ргопролиналем
2.1.4. Изучение функций выявленных кишечных Т. i
2.1.4.1. Локализация
2.1.4.2. Динамика изменения активности в процессе пищеварения
2.1.5. Состав пищеварительного пролинспецифичного комплекса личинок
. i
2.2. Идентификация глутаминспецифичных пептидаз в пищеварительном комплексе личинок Т. i
2.2.1. Локализация активности
2.2.2. Гельхроматография экстрактов и РМ личинок 7 i
2.2.3. Анализ препаратов
2.2.3.1. Зависимость активности препаратов от
2.2.3.2. Ингибиторный анализ препаратов Г
2.2.3.3. Постэлекгрофоретическос исследование препаратов
2.3. Гидролиз глиадинов
3. Экспериментальная часть
3.1. Получение белковых экстрактов
3.2. Определение ферментативной активности пептидаз
3.2.1. Измерение активности по хромогенным субстратам
3.2.2. Измерение активности по реакции с нингидрином
3.2.3. Тестирование активности Рер4 методом ВЭЖХ
3.3. Фракционирование экстрактов из и РМ
3.4. Очистка пептидазы Рер4
3.5. Изучение зависимости акгивности ферментов от
3.6. Изучение стабильности при различных значениях
3.7. Изучение влияния ингибиторов и активаторов
3.8. Изучение влияние температуры на активность
3.9. Изучение температурной стабильности
3 Электрофорез препаратов пептидаз и постэлекгрофоретическое тестирование протеолитичсской акгивности
3 Определение первичной структуры пептидазы Рер4
3 Анализ первичных структур
3 Изучение ферментативного гидролиза глиадинов
31.Элсктофорстическое тестирование гидролиза глиадинов
32.Определение количества образовавшихся МН2групп
при гидролизе глиадинов с помощью нингидрина
Выводы
Благодарносги
Список литературы


Эти ферменты гидролизуют связи по карбонилу Рго в олигопептидах, содержащих не более аминокислотных остатков. РОР были открыты как ферменты, расщепляющие окентоцин гормон пептидной природы 2. РОР были выделены из млекопитающих 36, рыб 7, насекомых 8,9, грибов и микроорганизмов . Оптимум большинства РОР находится в диапазоне от 7,0 до 8,5 1,. Температурный оптимум активности этих ферментов соответствует 9С. Молекулярные массы РОР находятся в пределах кДа . Изоэлектрические точки РОР млекопитающих расположены в интервале от 4,5 до 4,9, а бактериальные РОР имеют i значительно выше, например, 6,2 для РОР из X и 9,6 для РОР из vi ii . В настоящее время установлены первичные структуры многих РОР Они относятся к семейству 9 ссриновых пептидаз по классификации МЕРОПС ,. Было показано, что эти пептидазы значительно отличаются от классических сериновых пептидаз. Главным различием является порядок расположения остатков каталитической триады в первичной структуре пептидаз классическим сериновым. РОР имеет топологию i 1. Предполагается, что РОР служат связывающим эволюционным звеном между семействами ссриновых пептидаз и сериновых карбоксипептидаз, имеющих такую же топологию каталитической триады, как и РОР 5. Активность большинства РОР подавляется в присутствии ингибитора сериновых пептидаз диизопропилфторфосфата . В то же время другой ингибитор сериновых пептидаз, фенилметилсульфонилфторид , лишь незначительно снижает их активность. Для некоторых РОР, например, для РОР из почки ягненка и из мышц свиньи, было показано частичное игибирование фермента под действием реагентов йодацегамида, 2, лхлоромеркурибензоата РСМВ, что свидетельствует о наличии в этих белках остатков цистеина, важных для их активности . Юп М 1 рис. Рис. Структура ингибиторов пролиналя а, циклогексилпролиналя Ь и тиопролилиролиналя с. Другие специфические ингибиторы типа II2I i 9 М алкилируют остаток активного центра фермента . Количество субсайтов и их стерсоспсцифичность были исследованы в работе на примере из почки ягненка. Было показано, что фермент имеет три подцентра для связывания остатков субстрата в концевом направлении от расщепляемой связи, , 2 и 3 субстрат вида X, где Хаа или , оказался лучшим. При увеличении или уменьшении длины субстрата параметр уменьшался табл. Субстраты вида или являются высокоспецифичными субстратами 1. Таблица 1. Кинетические парамегры гидролиза субстратов общей формулы X 02, катализируемого из почки ягненка . Р4 Рз Р2 . Как видно из табл. Р2 положении оказывается хуже, чем . Аналогичная картина наблюдается для из археи i для этого фермента параметр кКт в 4 раза выше для субстрата 0 мМ1 с1 по сравнению с его глицинсодержащим аналогом 6 мМ1 с1 . В то же время для из vi ii глицинсодержащий субстрат гидролизуется с большей эффективностью в 1,5 раза выше, чем у аланинсодержащего субстрата . Влияние аминокислотного остатка в Р2 положении на скорость гидролиза было исследовано с использованием ряда флуорогенных субстратов вида X, где Хаа , Вое, , i, , , , , . Было показано, что фермент имеет высокое сродство ко всем субстратам, и они могут применяться для флуорометричсского определения активности. В сайте связывания 2 фермента могут помещаться как остатки с объемными гидрофобными, так и с заряженными заместителями. Присутствие алифатического или ароматического заместителя в боковом радикале не приводит к заметному изменению констант гидролиза субстратов . Увеличение длины цепи в сторону Сконца приводит к увеличению ксмКт до положения Р2 табл. При дальнейшем увеличении цепи происходит понижение эффективности гидролиза. Следовательно, можно сказать, чтофермент имеет два нодцентра, и 2 для связывания аминокислотных остатков с Сконца от расщепляемой связи. Таким образом, из почки ягненка имеет 5 подцентров для связывания субстрата i , 2, 3, и 2. Аналогичные результаты получены для из бактерии vi ii и гриба i . Исследование гидролиза субстратов, содержащих аминокислоты, показало, что только подцентры 2, и являются стереоспецифическими табл.