Влияние мутаций в элементах 23S pPHK на функционирование факторов элонгации Escherichia coli

• Автор: Бураковский, Дмитрий Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1 ФАКТОРЫ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фактор элонгации Ти

1.1.1 Структура фактора элонгации Ти

1.1.2 Связывание амнноацилтРНК фактором элонгации Ти

1.1.3 Структура комплекса .

1.1.4 Расположение фактора элонгации Ти на рибосоме

1.1.5 Функционирование фактора элонгации Ти

1.1.5.1 Начальное связывание

1.1.5.2 Узнавание кодона

1.1.5.3 Стимуляция гидролиза

1.1.5.4 Гидролиз
1.1.5.5 Высвобождение фосфата и кон формационные перестройки фактора элонгации Ти
1.1.5.6 Аккомодация аминоацилтРНК
1.2 Фактор элонгации
1.2.1 Структура фактора элонгации
1.2.2 Расположение фактора элонгации на рибосоме
1.2.3 Взаимодействие факторов элонгации со стеблем 7
1.2.3.1 Роль белка 7 в связывании факторов элонгации с рибосомой
1.2.3.2 Роль 7 в стимуляции СТРазной активности факторов элонгации
1.2.4 Траислокация
1.2.4.1 Структурные изменения рибосомы при транслокации
1.2.4.2 Структурные изменения фактора элонгации при транслокации
1.2.5 Кинетика функционирования фактора элонгации
1.2.6 Транслокация и ретротранслокация
1.2.7 Участие фактора элонгации в диссоциации посттерминационного комплекса
2 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1 Влияние мутаций в спирали рРНК на функционирование факторов элонгации
2.1.1 Постановка проблемы
2.1.2 Влияние мутаций на скорость роста клеток и точность трансляции i viv
2.1.3 Очистка мутантных рибосом
2.1.4 Влияние мутаций на конформацию I 1К согласно данным химического пробинга
2.1.5 Влияние мутаций на элонгацию трансляции i vi
2.1.6 Связывание факторов элонгации с рибосомой
2.1.7 Стимуляция СТРазной активности при соответствии кодона мРНК и антикодона тРНК
2.1.8 Стимуляция СТРазной активности деацилнрованной тРПК, связанной с участком рибосомы
2.1.9 Обсуждение
2.2 Изучение влияния мутаций рРНК на скорость аккомодации ачнноацнлтРНК
2.2.1 Постановка проблемы
2.2.2 Влияние мутаций на скорость роста и точность трансляшш i viv
2.2.3 Выделение и очистка мутантных субчастиц
2.2.4 Исследование способности мутантных рибосом образовывать иннциаторный комплекс и синтезировать дипептид
2.2.5 Влияние мутаций на эффективность стадий элонгации i vi
2.2.6 Влияние мутаций на скорость аккомодации амииоацилтРНК
2.2.7 Детальное исследоваше рибосом, имеющих мутацию 3 рРНК
2.2.8 Обсуждеше
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Реактивы и биопрепараты
3.2 Буферы и растворы
3.3 Создание штаммов для экспрессии рибосом с мутацией в рРНК
3.4 Измерение скорости роста клеток
3.5 Измерение точности трансляции
3.6 Выделение компонентов для экспериментов i vi
3.6.1 Выделение рибосом
3.6.2 Получение 0 экстракта без тРНК
3.6.3 Получение аминоацилтРНК
3.6.3.1 Получение . i
3.6.3.2 Получение ,4. i
3.6.3.3 Получение тРНК1 . i
3.6.4 Получение мРНК
3.7 Тестирование способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции i vi при помощи тоупрннтннга
3.8 Эффективность полиизавиенмого синтеза полиРЬс
3.9 Стимуляция 3 активности фактора элонгации
3. Стимуляция 3i активности фактора элонгации
3. Химический пробинг
Модификация диметилсулъфатом
Модификация кетоксалем
Модификация карбодиимидом
Выделение суммарной рибосомной РНК
Реакция обратной транскрипции
3. Футпрннтннг ИЗ
3. Образование инициаторных комплексов, связывание амнноацнлтРНК в участок и синтез дипептида
Формирование инициаторных комплексов
Формирование тройного комплекса
Образование дипептида и пуромищшовая реакция
Связывание аминоацилтРНК в участок рибосом с мутацией 3
4 ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Рпетля соответствует петле 1 состоит из нескольких консервативных аминокислот, которые взаимодействуют с рфосфатом связанного нуклеотида и координируют ион 2, необходимый для связывания нуклеотида. Переключатель I соответствует петле 2 и переключатель II соответствует петле 3 и части следующей за ней аспирали 9 представляют собой области, которые значительно изменяет свою конформацию в зависимости от связанного нуклеотида. Цикл работы всех СТРаз включает в себя три различные конформации белка активную конформацию, неактивную конформацию и свободное состояние без нуклеотида. У многих но не у всех 3 скорость диссоциации и собственная скорость гидролиза невелики, поэтому ключевыми участниками циклов функционирования практически всех 3 являются факторы обмена нуклеотида, осуществляющие обмен на и переключение СТРазы в активное состояние, и факторы, стимулирующие СТРазную активность, значительно увеличивающие скорость гидролиза 8 рис. Рисунок 3. Цикл работы ОТРаэ. Для и фактором, стимулирующим гидролиз является рибосома в соответствующем функциональном состоянии. Роль фактора, обменивающего на , играет фактор элонгации для . Обмен нуклеотида у происходит без участия других факторов. Предполагают, что внутренним фактором обмена нуклеотида у может служить свойственная только этому белку часть домена, которая называется доменом ,. ФАКТОРЫ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Да. А и , , различающимися тринадцатью нуклеотидами, однако продукты этих генов идентичны за исключением Сконцевых аминокислот в случае это глицин, а в случае серии. Существование двух практически идентичных генов кодирующих может быть частью сложного биорегуляторного механизма. Функция в клетке заключается в доставке аминоацилтРНК аатРНК на рибосому. РНК кроме инициаторной и селеноцистеилтРНК, образуя при этом комплекс , который в литературе принято называть тройным комплексом. В составе тройного комплекса аатРНК доставляется на рибосому, где связывается с участком рибосомы. I. Структурные изменения при переходе от к конформации хорошо охарактеризованы. РНК , . Особенно важно, что в различных комплексах структурированы переключатели I и II, что позволяет связать структурные перестройки в этих областях при гидролизе с изменениями конформации всего фактора в целом. При гидролизе конформационным перестройкам подвергаются прежде всего переключатели I и II, что приводит к сильному изменению положения доменов II и III относительно домена , , и изменению размера полости между доменами рис. Рисунок 4. Сравнение i в комплексе с А, В и Т. Б, Г . Переключатель I обозначен желтым, переключатель II оранжевым, и красным, ион магния фиолетовым. Доставку аминокислотных остатков из цитоплазмы на рибосому для синтеза белка осуществляет транспортная РНК тРНК при помощи . Основные структурные элементы тРНК это антикодоновый стебель, антикодон, петля, Тпетля и акцепторный стебель рис. РНК по отношению к присоединяемому аминокислотному остатку. Т петли получили свое название благодаря наличию в них уникальных модифицированных нуклеотидов дигидроуридина в петле и риботимидина и псевдоуридина в Тпетле. Акцепторный стебель образован 3 и 5концами тРНК, причем выступающий Зконец всегда содержит консервативную последовательность ССА. Именно на Зконцевой аденозин ферменты аминоацилтРНК синтетазы присоединяют остаток той или иной аминокислоты. Акцепторный
Рисунок 5. Основные структурные элементы транспортной РНК . В связывании аатРНК комплексом ЕРТиОТР принимают участие одновременно все три домена ЕРТи. РНК и Тпетля. Структура тройного комплекса лучше всего была изучена на примере комплекса ЕРТи Т. Нсиа, СЭРЫР и дрожжевой РИетРИК6 . Остаток фенилаланина находится в кармане между доменами I и II. Этот карман достаточно большой для того, чтобы в него поместился любой из остатков природных аминокислот. Контакты, образующиеся между фактором и аминокислотой, требуют наличия аминоэфирной группы, характерной для всех аатРНК. Формильная группа, характерная для инициаторной АМтРНКШс1, препятствует образованию подобных контактов. За исключением Зконцевого аденозина, который связывается в специальный карман, ССАконец взаимодействует с ЕРТи в основном за счет своих фосфатных групп.