Фотомодификация тирозина и триптофана арилазидами в условиях сближения реакционных центров

• Автор: Мищенко, Елена Леонидовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 104 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ФОТОВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АРИЛАЗИДОВ С

АНАЛОГАМИ БОКОВЫХ РАДИКАЛОВ АМИНОКИСЛОТ И АМИНОКИСЛОТАМИ обзор литературы.

1.1. Интермедиаты, образующиеся при фотолизе фенил азида и их характеристики.

1.2. Фотолиз арилазидов в присутствии нуклеофилов.

1.2.1. Фотолиз в присутствии аминов.

1.2.2. Механизм реакции фотолитического образования ЗЯазепинов.

1.2.3. Кинетика реакций образования 1 Я и ЗЯазепинов.

1.2.4. Влияние заместителей, введенных в молекулу фенилазида,
на процесс циклизации сииглетных арилнитренов.
1.2.5. Фотолиз фторзамещеиных арилазидов в присутствии
аминов.
1.2.6. Фотолиз арилазидов в спиртах и тиоспиртах.
1.2.7. Фотовзаимодействие полифторзамещенных арилазидов с модельными соединениями боковых радикалов
аминокислот.
1.2.8. Фотолиз азидоанилина и его производных в водных
растворах.
1.3. Фотолиз арилазидов в ароматических растворителях.
1.3.1. Фотолиз фенилазида и его замещенных производных.
1.3.2. Фотолиз фторзамещенных арилазидов.
1.4. Фотолиз арилазидов в насыщенных углеводородах.
1.5. Реакции триплетных арилнитренов.
1.6. Фотовзаимодействие арилазидов с аминокислотами и модельными соединениями боковых радикалов аминокислот
в комплементарных комплексах.
ГЛАВА 2. ПРОДУКТЫ ФОТОВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОСТАТКОВ 5АЗИДО2НИТРОБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ И ТИРОЗИНА результаты и обсуждение.
2.1.1. Синтез арилазидного производного тирозина ХХХ1а.
2.1.2. Изучение фотолиза соединения ХХХ1а.
2.1.3. Идентификация устойчивых продуктов фотопревращения соединения ХХХ1а.
2.1.4. Исследование неустойчивых продуктов фотопревращения соединения ХХХ1а.
2.1.5. Пути образования устойчивого продукта внутримолекулярной фотомодификации остатка
Туг XXXIVа.
2.2.1. Изучение фотолиза ЛгтирозилЛ5азидо2нитробензоил1,4диаминобутана ХХХ.
2.2.2. Идентификация устойчивых продуктов фотопревращения соединения ХХХ.
2.2.3. Исследование неустойчивых продуктов фотопревращения соединения ХХХ.
2.3.1. Синтез новых фотоактивных аналогов биотина.
2.3.2. Фотохимические свойства аналогов биотина XXXIX и ХЬ.
2.3.3. Взаимодействие фотоаналогов биотина XXXIX и ХЬ
со стрептавидином.
2.3.4. Получение индивидуальных пептидов стрептавидина, модифицированных фотоаналогами биотина XXXIX и ХЬ.
2.3.5. Ссквенированис модифицированных пептидов.
Определение точек модификации.
2.3.6. Электронные спектры поглощения модифицированных пептидов стрептавидина.
2.3.7. Оценка степени модификации стрептавидина
остатком фотобиотина XXXIX.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


К началу выполнения данного исследования г, в работах, посвященных фотоаффинной модификации индивидуальных белков, приводились лишь отдельные сведения об аминокислотных остатках, подвергшихся модификации. Отсутствие таких знаний во многом объясняется трудностью накопления достаточных количеств индивидуальных модифицированных пептидов для их анализа с помощью ЯМР спектроскопии. Лишь в единственном случае пептид фрагмента Кленова ДНК полимеразы I . Туг6 был найден модифицированным остатком 5азидо2нитробснзойной кислоты, введенным по С5 положению остатка праймера в ДНКдуплекс праймерматрица, был охарактеризован электронной спектроскопией . Решение сложной проблемы установления структур продуктов модификации аминокислотных остатков целесообразно начать с исследования фотолиза модельных соединений, в которых аминокислотный остаток, подвергающийся модификации в белках, сближен при помощи линкера с арилазидной группой на расстояние, сопоставимое с расстоянием между реагирующими остатками при фотоаффинной модификации белков. Другой моделью исследования может являться аффинная модификация стрептавидина арилазидными аналогами биотина. В этом случае сближение реагирующих остатков аминокислот и арилазидов можно осуществить через аффинное стрептавидинбиотиновое взаимодействие. Стрептавидин является тетрамером м. М. Каждая субъединица стрептавидина имеет единственный и независимый центр связывания с биотином , . Первичная структура субъединицы стрептавидина 9 аминокислотных остатков известна . Свойства стрептавидина могут позволить осуществить эффективную аффинную модификацию этого белка арилазидными производными биотина и накопить фотомодифицированные пептиды в количествах, достаточных как для их секвенирования, так и регистрации электронных спектров поглощения. Целью данного исследования явшось изучение продуктов фотовзаимодействия арилазидов и аминокислот в условиях сближения реакционных центров на примере внутримолекулярной фотомодификации остатка тирозина в модельных соединениях и фотомодификации стрептавидина. Модельные соединения, в которых аминокислотный остаток и арилазидная группа сближены через неприродный линкер, а также стрептавидинбиотиновая модель сближения остатков аминокислот и арилазидов были предложены с. Годовиковой Т. С. в Лаборатории исследования модификации биополимеров НИБХ СО РАН, руководимой академиком Кнорре Д. ГЛАВА 1. ФОТОВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АРИЛАЗИДОВ С АНАЛОГАМИ БОКОВЫХ РАДИКАЛОВ АМИНОКИСЛОТ И АМИНОКИСЛОТАМИ обзор литературы. Интермедиаты, образующиеся при фотолизе фснилазида и их характеристики. Фенилазид является простейшим соединением из довольно обширного класса ароматических азидов. Фотолиз фенилазида приводит к фотодиссоциации с отщеплением молекулы азота и образованием высокореакционного синглегного фенилнитрена ключевого интермедиата, который определяет природу последующих промежуточных продуктов. В диапазоне концентраций фенилазида 1 I4 М квантовый выход фотодиссФциации ф составляет ф 0. Будыка и др. Грицан и Притчина, . Синглстный фенилнитрен образуется также при пиролизе фенилазида и восстановлении нитро и нитрозобензола в присутствии реагентов трехвалентного фосфора ЕЮзР, , ЕЮгРМе I . В растворах при комнатной температуре время жизни т синглетного фенилнитрена чрезвычайно мало оценочная величина т 0 пс, полученная с помощью расчетов, приведена в работе v . УФ спектроскопии Грицан Н. П. и соавторами i . А 0 нм i . Согласно квантовохимическим расчетам, один электрон атома азота синглетного фенилнитрена участвует в образовании связи, пара электронов находится на несвязывающей орбитали, ось которой совпадает со связью , а два других валентных электрона могут находиться на несвязывающей а орбитали, расположенной в плоскости фенильного кольца, и на несвязывающей р орбитали, перпендикулярной этой плоскости открытая сиг синглетная конфигурация. Эти же два электрона могут оба занимать о орбиталь, оставляя незанятой рл орбиталь закрытая о2 конфигурация или оба могут занимать рл орбиталь, оставляя незанятой о орбиталь закрытая л2 конфигурация Схема 1. Синглетные конфигурации л2 и о2 сопоставимы но энергии, которая выше энергии синглетной сл конфигурации , .