Характеристика эффекторного центра неорганической пирофосфатазы Escherichia Coli

• Автор: Ситник, Татьяна Сергеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. РОЛЬ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ПИРОФОСФАТА3.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. НИРОФОСФАТАЗЫ ИХ РОЛЬ, ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ В КЛЕТКЕ.

1.2. Первое семейство пирофосфатаз

Свойства иолов металлов в центре .

Свойства иолов металлов в центре М2

Свойства иолов металлов в центре М3

Взаимодействие центров М1 и М2 и их роль в катализе

Свойства иона металла в центре М4

Свойства мсжтримерных ионов магния.
1.3. Второе семейство пирофосфатаз.
Влияние различных ионов металлов в центрах и М2 на структуру и
катачитические свойства пирофосфатаз семейства II
Константы диссоциации ионов металлов в центре высокого сродства
Изучение функционирования и свойств РРаз семейства II с использованием
мутантных вариантов
Сравнение структур и механизмов гидролиза пирофосфатаз двух семейств
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ
П И РОФОСФ АТ АЗЫ II I.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Характеристика мутантных вариантов неорганической пирофосфатазы
.i.
Получение мутантных вариантов
Связывание 2 с ферментами и с ферментсубстратными комплексами
Кинетика гидролиза субстрата мутантными вариантами Е РРазы
Кинетические характеристики тримерной формы С1пРРазы.
Влияние метилендшросфоната на гидролиз субстрата нативной РРазой и ее
мутантными вариантами
Термическая и химическая денатурация.
2.2. Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе МсРР,.
3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
i В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА.
3.1. Гидролиз , ЕРРазой и УРРазой
3.2. Влияние метилендифосфоната на гидролиз ,
Проверка возможности комплексообразования с Р
Гидролиз , в присутствии РСР.
3.3. Влияние на гидролиз ,
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
4.1. Исходные вещества.
4.2. Методы исследования.
Обессоливаиие растворов белка
Определение концентраций веществ.
Определение ферментативной активности
Определение олигомерных форм фсрмснтов. Ссдиментационный аначиз.
Спектрофотометрическое титрование
4.3. Расчет концентраций компонентов реакционной смеси
4.4. Изучение зависимости скорости гидролиза , от концентрации свободных ионов магния
Определение константы связывания 2 в центре М2
Определение константы связывания 2 в центре М4
4.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия
4.6. Химическая денатурация
4.7. Получение тримерных форм ЕРРазы и изучение их свойств.
4.8. Гидролиза субстрата гексамерными формами мутантных вариантов ЕРРазы.
4.9. Влияние метилендифосфоната на гидролиз ,.
4. Гидролиз , нативной и мутантными вариантами ЕРРазы
Гидролиз , гексамерной и примерной формами нативной ЕРРазы и
РРазой.
Зависимость скорости гидролиза , от концентрации свободных ионов
магния.
4 Влияние метилендифосфоната на гидролиз ,
Гидролиз фиксированной концентрации в широком диапазоне концентраций
Влияние фиксированной концентрации на гидролиз .
4 Влияние на гидролиз ,
4 Влияние и метилендифосфоната на гидролиз , и ,.
4 Попытки кристаллизации комплексов нлтивной ЕРРлзы с , и .
Кристаллизация ЕРРазы в присутствии ,.
Кристаллизация ЕРРазы в присутствии .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Связывание в эффекторном центре негидролизусмого аналога субстрата магний метилендифосфоната вызывает ускорение гидролиза , под действием не только ЕРРазы, ее мутантных вариантов и тримерной формы этого фермента, а также дрожжевой РРазы, причем удастся достичь скорости гидролиза близкой к той, с которой гидролизуется природный субстрат . В присутствии эффектора не только растет скорость гидролиза, но также происходит исчезновение асимметрии субъединиц и сильно возрастает сродство ферментов к . Обзор литературы посвящен роли ионов металлов в функционировании пирофосфатаз обоих семейств. Характерной особенностью этих ферментов является участие в катализе 34 ионов двух валентных металлов, среди которых наибольшая активность в семействе РРаз I проявляется в присутствии ионов магния, а в семействе II ионов марганца. Пирофосфатазы их роль, функционирование в клетке. Растворимые неорганические пирофосфатазы РРазы, ЕС 3. Пирофосфат принимает участие как субстрат или продукт более чем в 0 метаболитических реакциях и регулирует активность множества ферментов 1, 2. Он образуется при синтезе многих биополимеров, и его гидролиз обеспечивает необходимое смещение равновесия. Цитоплазматические пирофосфатазы РРазы делятся на два семейства I и II, представители которых отличаются аминокислотными последовательностями и пространственными структурами. Но их объединяют общие принципы механизма гидролиза фосфоангидридной связи. Первое семейство более многочисленно и хорошо изучено 3, 4, 5, тогда как второе семейство привлекло к себе внимание сравнительно недавно 6. Растворимые пирофосфатазы семейства I разделяются согласно их источникам на два подсемейства прокариотическое и эукариотическое. В настоящее время, благодаря успехам в расшифровке большого числа геномов, стала известна первичная структура около сотни РРаз семейства I. Однако пространственная структура определена только для четырех ферментов, выделенных из ii i ЕРРазы, из vi РРазы, из i ТРРазы 7 и из ii РРазы 8. Наиболее хорошо изучены РРазы из дрожжей и . ЕРРаза гомогексамер, с молекулярной массой 0 кДа, а РРаза гомодимер с массой кДа . Субъединицы пирофосфатаз семейства I являются одподомсипыми белками, ядро которых образовано баррелем. Природным субстратом РРаз является пирофосфат магния . Наиболее эффективным активатором ферментов первого семейства являются ионы 2 . Физиологический диапазон свободных концентраций которых в клетке лежит в районе 0,51 мМ , , . В качестве ионов активаторов могут выступать также ноны переходных металлов 2, 2, Со2 ионы же Са2 являются эффективными ингибиторами РРаз семейства I. Помимо пирофосфата, в определенных условиях некоторые РРазы этого семейства расщепляют полифосфаты и органические эфиры ди и триполифосфорных кислот , . Субстратная специфичность в этих случаях зависит от природы актнваториого иона металла. РРаза гидролизует органические субстраты, такие как , , Опирофосфоэтаиоламин, метилпирофосфат и другие эфиры полифосфорной кислоты, в присутствии элементов 2 или Мп2, по не 2 , , а ЕРРаза гидролизует метилпирофосфат в присутствии 2 или 2 а АТР только в присутствии ионов Мп2 . Изучение второго семейства пирофосфатаз началось с работы Тоно и Корнберга , которым удалось охарактеризовать фермент из i ii РРаза Однако интенсивно представители этого семейства стали исследоваться только с конца х годов. На сегодняшний момент известно около представителей второго семейства один фермент из одноклеточного эукариотического организма ii i, три из археабактерий и из патогенных микроорганизмов. Во второе семейство входят представителей эубактерий, таких как i ii и различные патогенные формы ii, и класса . Последний класс включает , вызывающий кариес, . РРаза, а также другие бактерии полости рта и . Активаторами гидролиза пирофосфата в случае РРаз семейства II являются ионы 2 и Мп2. Причем, если в случае 2 активности обоих семейств практически одинаковы, то в случае Мп2 активность РРаз семейства II значительно возрастает. Таким образом, в отличие от семейства I ионы Мп2 являются наиболее эффективными активаторами РРаз семейства II .