Получение искусственных биокатализаторов на основе антител, способных осуществлять "ковалентный катализ"

• Автор: Решетняк, Андрей Васильевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

Оглавление

1. ВВЕДЕНИЕ ММ1М1ННМИНМИМ0ИИИММНМММММИвО1МИММ0МН1

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ МИ0ММИННМ0МНММНИМММ0НИИ1Н1НИНИМ1

2.1 Искусственные ферменты мммммммммммнмммимммм0ммимммм

2.1.1 Искусственные ферменты на основе циклодекстринов

2.1.2 Синтетические полимеры с фериентподобной каталитической активностью

2.1.3 Инженерия ферментов.

2.1.4 Целенаправленное изменение ферментов

2.1.5 Метод фагового дисплея как инструмент для целенаправленного изменения ферментов.

2.2 Каталитические антитела ммтммтим.1.мммм.мм1ммми1ммм.жммм

2.2.1 Антитела на аналоги переходных состояний.

2.2.2 Абзимы, содержащие кофакторы.
2.2.3 Введение каталитических аминокислотных остатков в связывающий центр антитела путем химической модификации или сайтнаправленного мутагенеза
2.2.4 Реакционная иммунизации
2.2.5 Природные каталитические антитела
2.2.6 Природные протеолитические антитела
2.2.7 Каталитические антиидиотипические антитела.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Индукция эпитопспецифического каталитического ответа методом
реакционной иммунизации ФФ9Ф9ФФ9ФФФФФФ9ФФФФФФФФФФФФФФФФФФ9Ф9ФФФФФФФФ9ФФ9ФФФ9ФФФФФФФФФФФ
3.2 Реакционная селекция антител из синтетической библиотеки генов иммуноглобулинов человека .
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1 Химические реактивы и материалы . .
4.2 Методы
Приложение 1.
Приложение 2.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Увеличение скорости реакции гидролиза пнитрофенил ацетата составляет более чем 3 раз по сравнению с некатапизируемым гидролизом. Синтетические полимеры с ферментподобной каталитической активностью. Для создания искусственных ферментов кроме циклодекстринов могут быть использованы другие водорастворимые синтетические полимеры, способные связывать небольшие молекулы . Удачным примером таких полимеров являются производные
Рис. Искусственная металопротеаза. И. Так лауроилполиэтиленимин способен ускорять гидролиз сложноэфирной связи более чем в 3 раз по сравнению с пропиламином. Такого ускорения удается достичь за счет высокой аффиности синтетического полимера и сложного эфира пнитрофенил лаурат, тем самым сильно повышая локальную концентрацию первичных аминогрупп . Весьма впечатляющим оказался результат воссоздания модели протеаз на основе поперечно сшитого полиэтиленимина. Исходя из того, что многие природные протеазы гидролизуют пептидную связь, используя небольшое число функциональных групп карбоксильная, имидазольная, гидроксильная или меркапто группы как основной элемент катализа, авторы смоделировали активный центр, состоящий из трех остатков салициловой кислоты , сходящихся в одной точке и прикрепленных к основной цепи поперечно сшитого полиэтиленимина 3I. Таким образом, активный центре такого полимера состоит из трех карбоксильных и трех фенольных групп остатков салициловой кислоты, а так же аминогрупп полиэтиленимина. Схематически активный центр 3I изображен на рисунке 2. При инкубации 3I общая концентрация 3 сайтов 4, 4 М с углобулином 5,6 М при С наблюдалась деградация белка, время полудсградации в этих условиях составляло 1ч. Весьма незначительная протеолитическая активность наблюдалась, когда остатки салициловой кислоты иммобилизовали на полиэтиленимин хаотически. Изучение зависимости константы скорости второго порядка от выявила оптимум активности при 67. Так как, и карбоксильная, и фенольная и аминогруппы могут играть каталитическую роль при 67, то крайне трудно сделать вывод какая именно из этих групп отвечала за протеолиз. Рисунок 2. Схема активного центра 3I. Инженерия ферментов. Попытки создать искусственные ферменты на основе синтетических полимеров являются весьма интересными и полезными, однако синтетические каталитические макромолекулы сильно уступают ферментам белковой природы. В последние время, с развитием генной и белковой инженерии, протеомики, а также компьютерного моделирования, становится все более перспективным дизайн белковых молекул, обладающих каталитической активностью. Огромные перспективы открываются благодаря возможности предсказывать, как изменение первичной последовательности белка повлияет на его структуру и функции. Более того, в настоящий момент можно предпологать, какие изменения в структуре нужно внести для создания биологически активного фермента . Первые эксперименты по созданию ферментов v были предприняты с использованием антител к переходному состоянию реакций и будут описаны далее, в разделе, посвященном каталитическим антителам. В этом разделе хотелось бы более подробно остановиться на создании рибонуклеазного абзима, полученного путем сайтнаправленною мутагенеза . Флетчер и соавторы взяли за основу уже существующее моноклональное антитело 3, специфичное к полиинозину . Анализируя структуру комплекса этого антитела с инозин дифосфатом, авторы заметили, что расположен в непосредственной близости от 2 гидроксила рибозного остатка, и предположили, что мутация на гистидин может способствовать снятию протона с 2ОН, инициируя тем самым внутримолекулярную атаку на фосфодиэфирную связь. Действительно, замена аргинина на гистидин привела к превращению антитела 3 в каталитическое, способное расщеплять полиг1 с каталитической эффективностью порядка 0 М1 сек1. Недавно были предприняты успешные попытки изменить ход каталитических реакций на примере двух ферментов ,. Циклофилин цистранс изомераза Х пептидной связи был переделан в эндопептидазу, ципразу 1, способную расщеплять пептидную связь с конца пролинового остатка . На основании анализа структуры циклофилинпептидного комплекса, в циклофилин .