Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами

• Автор: Приказчикова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

Введение

1. Ингибиторы интегразы вируса иммунодефицита человека

и механизм их действия обзор литературы.

1.1. Интеграза ВИЧ1 строение и функции.

1.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ

1.2.1. Низкомолекулярные ингибиторы

1.2.1.1. Производные дикетокислот.

1.2.1.2. Производные нафтиридина

1.2.1.3. Стирилхинолиновые ингибиторы.

1.2.1.4. Ьцикориевая кислота и ее производные

1.2.1.5. Производные гидроксикумарина.

1.2.2. Пептиды и антитела
1.2.3. Олигонуклеотиды.
2. Интеграза ВИЧ1 ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами
результаты и обсуждение.
2.1. Оптимизация структуры олигонуклеотидного
ингибитора интегразы ВИЧ1.
2.1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ
2.1.1.1. Дизайн и синтез конъюгатов.
2.1.1.2. Влияние структуры ненуклеотидной части
конъюгата на его ингибирующую активность
2.1.1.3. Влияние положения ненуклеотидной части в структуре конъюгата на его
ингибирующую активность.
2.1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части
ингибитора интегразы ВИЧ
2.1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на
ингибирующую активность конъюгата
2.1.2.2. Влияние модификаций углеводофосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую
активность его конъюгатов
2.1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность
некоторых ДНКсвязывающих ферментов.
2.1.4. Проверка ингибирующей активности конъюгатов метилолигонуклеотида с эозином и олеиновой
кислотой
2.2. Механизм действия олигонуклеотидных конъюгатов.
Определение участка связывания ингибитора
2.2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на
устойчивость комплекса интегразы ВИЧ1 с ДНК
2.2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ1 и определение
участка связывания
2.2.2.1. Дизайн и синтез олигонуклеотидных ингибиторов, содержащих 2,3дигидроксипропильную
группировку при атоме уридина.
2.2.2.2. Оптимизация условий ковалентного
присоединения ингибитора к интегразе.
2.2.2.3. Получение препаративного количества ковалентно связанного комплекса ингибитора Т2Р1 с интегразой, его триптический гидролиз и подготовка продуктов гидролиза к массспектрометрическому анализу
2.2.2.4. Массспектрометрический анализ продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного
комплекса ингибитора с интегразой
2.3. Доставка олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ1 в клетки
2.3.1. Оптимизация условий формирования комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями.
2.3.2. Проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки
2.3.2.1. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями.
2.3.2.2. Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного
ингибитора с рЭМАЕМА
Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных
ингибиторов на ВИЧинфицированных клетках
3. Экспериментальная часть.
3.1. Реактивы иматериалы
3.1.1. Реактивы.
3.1.2. Ферменты.
3.1.3. Олигонуклеотиды
3.1.4. Буферные растворы
3.2. Методы.
3.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином,
эозином и тетраметилродамином.
3.2.2. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов
на каталитическую активность интегразы ВИЧ
3.2.3. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов
на каталитическую активность фрагмента Кленова
3.2.4. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность эндонуклеазы
рестрикции Мбр 9Ш.
3.2.5. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов
на каталитическую активность мутантов интегразы ВИЧ1.
3.2.6. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов
на каталитическую активность интегразы ПВЧ
3.2.7. Изучение действия олигонуклеотидных конъюгатов
на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ1 с ДНК.
3.2.8. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ1 и определение
участка связывания
3.2.9. Изучение проникновения олигонуклеотидного
конъюгата в клетки
Приложение.
Выводы.
Литература


Прежде чем приступить к рассмотрению ингибиторов интегразы, считаем необходимым, привести основную информацию о строении и функциях самого фермента. Интеграза ВИЧ1 представляет собой белок с молекулярной массой кДа, состоящий из 0 аминокислотных остатков. Ее относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят ретровирусные интегразы, транспозазы, белки рекомбинации КцуС и ЯцуХ, а также ряд других белков . Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению ДНК или ее фрагментов внутри генома либо между геномами. Данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энергии и, в конечном итоге, без изменения числа фосфодиэфирных связей. Для ферментов данного семейства характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНКеубстратом. Однако катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК . Интеграция протекает в несколько стадий , . Она начинается в цитоплазме ВИЧинфицированных клеток, где по завершению обратной транскрипции вирусного РНКгенома интеграза связывает вирусную ДНКкопию ДНКсубстрат, формируя так называемый прединтеграционный комплекс ПИК. Структурная организация ПИК, а также роль каждого его компонента до настоящего времени полностью не установлена. Известно, что помимо интегразы и вирусной ДНК в его состав входят вирусная обратная транскриптаза, ряд вирусных, а также клеточных белков 6, 7. Каталитически активный ПИК может быть выделен из ВИЧинфицированных клеток 8, 9. Связывание интегразы с вирусной ДНК является сиквенсспецифичсским, она узнает концевые последовательности 5 и Ш участков длинных концевых повторов ДКП вирусной ДНК. Связав вирусную ДНК, интеграза катализирует реакцию 3процессинга. Эта реакция представляет собой эндонуклсазное расщепление вирусной ДНК, в результате которого с 3конца каждой цепи удаляется динуклеотид йТ. В ходе этой реакции Згидроксильные группы процессированных цепей вирусной ДНК атакуют межнуклеотидные фосфаты обеих цепей клеточной ДНК ДНКмишени с образованием ковалентного продукта. Переэтерификации подвергаются межнуклеотидные связи, расположенные в различных цепях ДНКмишени на расстоянии 5 пар нуклеотидов одна от другой. Встраивание вирусной ДНК может осуществляться в любое место клеточной ДНК, но преимущественно направлено на последовательности генома с нарушенным или ослабленным стэкингом . Для осуществления Зконцевого процессинга и переноса цепи интегразе необходим ион двухвалентного металла. Вероятнее всего, i viv роль металлакофактора играют ионы 2 , однако в исследованиях i vi нередко в качестве кофактора интегразы используют ионы Мп2. В структуре фермента выделяют три домена концевой, каталитический и Сконцевой ,, , . До настоящего времени, несмотря на многократные попытки, получить точную информацию о строении полноразмерного фермента не удалось. Неудачи связаны с низкой растворимостью интегразы, а также ее склонностью к агрегации, что приводит к сложностям при ее кристаллизации. Тем не менее, с помощью либо рентгеноструктурного анализа, либо ЯМРспектроскопии было установлено строение отдельных доменов, а также белков, включающих два домена интегразы ,,,,, . Каталитический домен, в сравнении с другими доменами интегразы ВИЧ1, наиболее консервативен по первичной структуре и сходен со строением каталитических доменов других ретровирусных интеграз и транспозаз . Он включает с по 2 аминокислотный остаток. Три из них, , и , формируют каталитический центр фермента. Они образуют, так называемый, , мотив, который является каноническим для ферментов класса полинуклеотидилтрансфераз . Мутации любого аминокислотного остатка из каталитической триады критичны для активности фермента . Согласно данным рентгеноструктурного анализа, структуру каталитического домена формируют пятитяжевой лист и шесть асииралей рис. Два аминокислотных остатка каталитической триады и , находятся в структуре Ртяжей i и Р4 и совместно с двумя молекулами воды координируют ион 2 . Третий аминокислотный остаток, , входит в состав а4спирали и, согласно структурным данным, полученным на сегодняшний день, в координации иона 2 не участвует .