Влияние холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов 5-липоксигеназой клеток млекопитающих

• Автор: Александров, Дмитрий Андреевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

1Л.1.2. Экзогенная АА нивелирует ингибирующее воздействие X и СХ на синтех лейкотриенов

Ш.1.З. СХ стимулирует адгезию РМЖ к коллагену и эндотелию

1П.1.4. Влияние СХ на доступность субстрата для 5ЬО

Ш.1.4.1. СХ препятствует высвобождению АА в РМЖ

Ш.1.4.2. СХ вытесняет сРЬА2 из ядерной мембраны РМЫЬ

Ш.1.5. СХ препятствует транс локации 5ЬО к ядерной мембране РМЖ

Ш.1.6. СХ подавляет активность 5ЬО в цитозольной фракции РМЫЬ

Ш.1.7. Исследование роли отрицательного заряда эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.

Ш.1.7.1. Синтез фосфата холестерина ФХ

Ш.1.7.2. Сравнение эффективности СХ и ФХ на разных типах клеток

1.1.8. Изучение кинетических закономерностей ингибирования 5ЬО анионными производными холестерина
Ш.1.8.1. СХ и ФХ подавляют синтез ЬТб в суспензионных клетках и клеточных гомогенатах
Ш.1.8.2. Получение кинетических характеристик ингибирования 5 под действием ФХ
1 Синтез лейкотриенов зависит от содержания холестерина в клеточных мембранах
1 1. Холестерин и СХ оказывают кумулятивное воздействие на синтез лейкотриенов
II2. Действие
Ш.П.2.1. увеличивает высвобождение АА из состава мембран
III.II.2.2. Подавление синтеза лейкотриенов под действием СХ снимается при помощи
Ш.П.З. Действие комплекса ПЭГхолестерин
Ш.П.4. Эффект СХ чувствителен к ингибиторам эндоцитоза
ШЛИ. Влияние эфиров холестерина на экспрессию 5 в различных клетках Гипотеза о роли ядериых рецепторов в регу ляции экспрессии 5 на уровне транскрипции
Ш.ШЛ. СХ способен подавлять экспрессию 5 в
Ш.1.2. Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов в регулировании экспрессии 5
IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
IV. 1. Реактивы и материалы
Буферные растворы
Подготовка рабочих препаратов
Синтез фосфата холестерина
IV.2. Методы исследования.
Выделение нейтрофилов
Культивирование клеточных линий 1 и ММ6
Выделение и культивирование эндотелиальных клеток
Приготовление коллагенированных поверхностей
Адгезия нейтрофилов к эндотелию и коллагену
Определение количества продуктов 5 активности в клетках
Синтез 5липоксигеназных продуктов в клетках.
Синтезб липоксигеназных продуктов в клеточных гомогенатах
Анализ 5липоксигеназных продуктов
Подготовка проб к хроматографии
Хроматографический анализ продуктов
Радиоактивно меченые РМИЬ
Определение внутриклеточной локализации 5липоксигеназы
Фракционирование нейгрофилов
Электрофорез
Влажный перенос на трансблоттере
Проявление мембраны
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Лейкотриены ЬТб представляют собой группу физиологически активных соединений, играющих важную роль как в системе защиты организма, так и в развитии воспалительных процессов рис. Установлено, что лейкотриеиьт являются медиаторами таких заболеваний как аллергия, экзема, бронхиальная астма, атеросклероз, сердечнососудистые заболевания, псориаз и другие. Кроме того, лейкотриены используются лейкоцитами в качестве молекул межклеточного взаимодействия и влияния на функцию других клеток. Лейкотриены являются продуктами диоксигенирования арахидоновой кислоты АА. В нейтрофилах человека ро1ушофЬопис1еаг 1еикос4е5, РМЫЬ ключевым ферментом синтеза лейкотриенов является 5липоксигеназа 5ЬО, КФ 1 Основными метаболитами А А в нейтрофилах являются лейкотриен В4 ЕТВ4 и 5гидроксиэйкозатетраеновая кислота 5НЕТЕ. Арахидоновая кислэта . Рис. Лейкотриены участники защитной системы организма и заболеваний воспалительной природы. Как уже упоминалось, лейкотриены участвуют в развитии множества заболеваний воспалительной природы. Так, роль лейкотриенов в общей патофизиологии астмы характеризуется участием в развитии бронхоспазма, нарушении проницаемости сосудов, секреции слизи, жизнедеятельности воспалительных клеток. Лейкотриены являются одними из основных индукторов артритных воспалений, причем к настоящему времени установлена прочная взаимосвязь между воспалительными процессами при артрите различной этиологии и развитием сердечнососудистых заболеваний. Так, при ассоциации ревматоидного артрита с дислииидемией, в анамнезе большой части пациентов наблюдается раннее развитие ишемической болезни сердца ИБС. Один из основных продуктов метаболизма АА лейкотриен В4 имеет существенное значение в развитии гнойного воспаления, и является мощным хемоагграктантом. Учитывая широкий спектр биологического действия лейкотриенов, подробное изучение механизмов регуляции их синтеза является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины. При развитии атеросклероза синтез лейкотриенов в лейкоцитах может модулироваться холестерином, огромное значение которого в атерогенезе является общепризнанным. В атеросклеротических бляшках обнаружен также сульфат холестерина СХ, однако его биологическая роль пока мало изучена. Исследование механизмов регуляции активности 5ЬО под действием холестерина и его эфиров особенно актуально в свете педавнего открытия того, что в атеросклеротических зонах резко повышена экспрессия 5ЬО. В этой связи, исследование действия сульфата и других производных холестерина на синтез лейкотриенов представляет несомненный интерес. Синтез лейкотриенов процесс, осуществляемый целым набором ферхментов и вспомогательных факторов. Информация о наиболее важных участниках синтеза лейкотриенов приводится в таблице 1. Несмотря на активные изыскания, к настоящему времени больших результатов в лечении воспалительных процессов путем подавления синтеза лейкотриенов или блокации их рецепторов пока не достигнуто. Обнадеживающие данные получены только по немногим областям, таким как лечение некоторых форм астмы, защита тканей сердца от последствий воздействия ионизирующего излучения при лучевой терапии и ряд других. Большинство известных ингибиторов 5липоксигеназы, хотя и многообещающие i vi, оказываются неприменимыми i viv. Чаще всего это происходит изза высокой токсичности и ряда опасных побочных эффектов. Цель работы состояла в изучении эффектов холестерина и его эфиров на активность 5, определении основных закономерностей взаимодействия указанных веществ с этим ферментом и другими участниками метаболического каскада АА. В данной работе для изучения подавления активности 5 и синтеза лейкотриенов были выбраны физиологичные соединения холестерин и его эфиры. Использование холестерина позволило моделировать условия начальных стадий развития атеросклероза с использованием эндотелиальных клеток и иейтрофилов и именно в этих условиях изучать синтез лейкотриенов. Полученные данные выявили важную роль отрицательно заряженных эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.