Структурно-функциональный анализ полипептидного токсина Lsp-1 из яда паука Lycosa и токсиномика яда паука Agelena orientalis

• Автор: Молявка, Антон Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Классификация нейротоксинов пауков

2.2. Особенности пространственной организации токсинов пауков, структура цистеинового узла

2.3. Нейротоксины пауков, действующие на калиевые каналы.

2.3.1 Нейротоксины из яда паука

2.3.2. Нейротоксины из яда паука vi.

2.3.3. Нейротоксины из яда паука iXi

2.3.4. Нейротоксины из яда паука

2.3.5. Нейротоксины из яда паука .

2.3.6. Нейротоксины из яда паука ii.

2.3.7. Нейротоксины из яда паука i iv.
2.4. Нейротоксины пауков, действующие на натриевые каналы.
2.4.1. Нейротоксины из яда паука x .
2.4.2. Нейротоксины из ядов пауков рода
2.4.3. Нейротоксины из яда паука i i.
2.4.4. Нейротоксины из яда паука i .
2.4.5. Нейротоксины из яда паука .
2.4.6. Нейротоксины из яда паука .
2.4.7. Нейротоксины из яда паука i iiv.
2.4.8. Нейротоксины из яда паука i
2.4.9. Нейротоксины из яда i i.
2.4 Нейротоксины из яда паука ix i
2.5. Нейротоксины пауков, действующие на кальциевые каналы
2.5.1. Нейротоксины из яда паука i .
2.5.1.1. соАгатоксины первой группы I.
2.5.1.2. соАгатоксины второй группы II
2.5.1.3. соАгатоксииы третьей группы I.
2.5.1.4. соАгатоксины четвертой группы IV.
2.5.2. Нейротоксины из ядов пауков родов и x.
2.5.3. Нейротоксины из яда паука i iiv.
2.5.4. Нейротоксины из яда паука
2.5.5. Нейротоксины из яда паука i
2.5.6. Нейротоксины из яда паука i i.
2.5.7. Нейротоксины из яда паука ii ii.
Заключение
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Выделение нейротоксина 1 из яда паука
3.2. Биологические свойства нейротоксина 1 из яда паука .
3.3. Установление полной аминокислотной последовательности токсина 1
3.4. Поиск гомологии с известными токсинами блокаторами ионных каналов
3.5. Получение рекомбинантного белка 1
3.5.1. Конструирование вектора и оптимизация условий экспрессии гибридного рекомбинантного белка Тгх в клетках . i
3.5.2. Получение рекомбинантного токсина 1 из состава химерного белка Тгх1.
3.6. ТОКСИНОМИКА ЯДА ПАУКА II.
3.6.1. Создание библиотеки нуклеотидных последовательностей кДНК.
3.6.2. Анализ библиотек нуклеотидных последовательностей кДНК паука ii.
3.6.3. Исследование базы данных последовательностей . ii с помощью структурных мотивов
3.6.4. Сравнение двух подходов анализа банка . ii.
4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Оборудование и материалы
4.1.1. Оборудование
4.1.2. Реактивы и ферменты.
4.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.
4.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы
4.2. Методы
4.2.1. Проведение гельфичьтрационной хроматографии
4.2.2. Выделение активной фракции .
4.2.3. Выделение токсина 1.
4.2.4. Восстановление дисульфидных связей и модификация групп остатков
цис теина
4.2.5. Определение частичной концевой аминокислотной последовательности
4.2.6. Гидролиз природного токсина 1 специфической.
ондперотеиназой
4.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
4.2.8. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и очистка фрагментов ДНК из агарозного геля
4.2.9. Лигирование фрагментов кДНК в линеаризованный вектор .
4.2 Получение и трансформация компетентных кчеток .i.
4 Трансформация методом теплового шока.
4 Трансформация методом электропорации.
4.2 Скрининг колоний .i, содержащих рекомбинантные молекулы плазмидной ДНК. с помощью ПЦР.
4.2 Выделение плазмидной ДНК.
4.2 Компьютерный анализ нукчеотидных и белковых последовательностей
4.2 Функциональная экспрессия генов в клетках .i.
4 Сборка гена зрелого токсина 1 методом ПЦР
4 Получение конструкци для экспрессии гена токсина 1.
4 Выделение гибридных рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии
4 Выделение рекомбинантных токсинов
4.2 электрофорез белков
4.2 Определение концентрации белка.
4.2 Определение количества белка в хроматографических фракциях по площади их пиков.
4.2 Массспектрометриярекомбинантных токсинов
4.2 Компьютерный аначиз электронных баз данных.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Примером такого подхода может служить анализ баз данных x последовательностей, созданных на основе ядовитых желез паука. Цель настоящей работы заключалась в идентификации и выделении из яда паука . Са2 каналам типа, определении аминокислотной последовательности, структуры гена и проведении функциональной экспрессии данного гена в бактериальной системе ii i, а также в анализе базы x последовательностей ядовитых желез паука ii с использованием структурных мотивов, характерных для токсинов блокаторов ионных каналов. Яды пауков это сложные природные системы, основными компонентами которых являются различные белковые, полипептидные и полиамидные нейротоксины, ферменты, свободные аминокислоты, нуклеиновые кислоты и неорганические соли 1. Нейротоксины с высокой степенью селективности воздействуют на различные компоненты центральной и периферической нервной системы, такие, как ионные каналы кальциевые Са2, натриевые Ыа и калиевые К, рецепторы и элементы пресинаптической мембраны, вовлеченные в передачу нервного импульса 2. Номенклатура нейротоксинов пауков основана на механизме их действия на определенные клеточные мишени, аналогично классификации, предложенной для конотоксинов Флетчером 3, 4. Данный тип классификации подразделяет токсины с известным механизмом действия, где к названию токсина прибавляется приставка буква греческого алфавита, характеризующая действие токсина или конкретного семейства токсинов. Приставка дельта б характеризует токсины, медленно инактивирующие потенциал зависимые натриевые каналы. Приставка мю р показывает, что данные токсины являются блокаторами натриевых каналов, так же как сакситоксин и тетродотоксин. Омега со это токсины, блокирующие потенциал зависимые кальциевые каналы, вовлеченные в нервномышечную передачу нервного импульса. Каппа к токсины, действующие на калиевые каналы БИакегтипа, вызывая судороги 4. Токсины, тя которых не найдены клеточные мишени, и для которых, соответственно, не определен механизм действия, принято называть по первым буквам видового иили родового латинского названия паука, с использованием арабской нумерации в порядке индивидуализации конкретного токсина, в ходе фракционирования цельного яда и поиска токсических компонентов. Полипептидные токсины, выделенные из ядов пауков, это в большинстве своем небольшие молекулы, состоящие из аминокислотных остатков, характеризующиеся молекулярными массами в пределах кДа. Количество остатков цистеина, входящих в состав этих молекул, варьирует от 6 до , и, что немаловажно, расположение остатков цистеина весьма консервативно рис. Большинство полипептидов этой группы содержит цистиновый узел, или Ингибиторный цистиновый узловой мотив I. Цистиновый узел представляет собой структурный элемент, состоящий из кольца, образованного двумя дисульфидными связями между первым четвертым и вторым пятым остатками цистеина и соединяющим их полипептидным тяжем. И проходящей сквозь это кольцо третьей связью между третьим шестым остатками цистеина рис. Возникновению такой конформации благоприятствует консенсусная последовательность XX3. X7ivXi. X4. X любая аминокислота, с попарным соединением, как уже говорилось, V, СцСу, СщV, которая, однако, не считается достаточным признаком мотива 3 ,5. Вторым признаком структуры цистинового узла является наличие слоя во вторичной структуре молекулы токсина, состоящего из двух или трех антипараллельных тяжей. Таким образом, вторичная структура нейротоксинов из ядов пауков, независимо от числа дисульфидных связей, характеризуется существенной долей антипараллельных тяжей, образующих сложную контактную поверхность, и неупорядоченных цепей, расположенных терминально и Сконцевые области полипептидной цепи 6. Такая компактная складчатая структура токсинов пауков, стабилизированная тремя семью дисульфидными связями, которые обеспечивают плотную упаковку молекулы, обусловливающую высокую химическую стабильность, устойчивость к денатурации и протеолизу, а также участвует в формировании контактной поверхности вокруг гидрофобного ядра.