Сходные черты в механизмах инициации трансляции у прокариот и эукариот

• Автор: Андреев, Дмитрий Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

1 Механизмы трансляции у прокариот и эукариот

1.1 Инициация трансляции

1.1.1 Прокариоты

1.1.2 Эукариоты

1.2 Элонгация

1.3 Терминация

2. Структура и функции рибосомы

3. Сравнение малых рибосомных субъединиц

3.1 рРНК
3.2 Рибосомные белки
3.2.1 Гомологичные рибосомные белки прокариот и эукариот
3.2.2 Рибосомные белки, уникальные для прокариот
3.2.3 Рибосомные белки, уникальные для эукариот
Результаты и их обсуяедение
1. Iэлемент вируса V способен направлять внутреннюю инициацию i viv
2. Безлидерная мРНК способна связываться с недиссоциированной рибосомой и инициаторной МеттРНКиМст в отсутствии факторов инициации трансляции
3. Тройной комплекс 8С1мРНКМеттРНКМст является функциональным элонгационным комплексом.
4. Образование инициаторного комплекса на мРНК
5 Необычные трансляционные свойства безлидерной мРНК
5.1 Увеличение уровня трансляции безлидерной мРНК при повышении ее концентрации в бесклеточной трансляционной системе
5.2 Трансляция безлидерной мРНК не зависит от кепа
5.3 Безлидерная мРНК эффективно транслируется
при частичной инактивации I2
6. Свойства безлидерной мРНК , которые позволяют ей
связываться с рибосомой.
Материалы и методы
1 Реактивы и материалы
2 Плазмидные конструкции
3 Генноинженерные манипуляции
4 Получение РНКтранскриптов
5 Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика
6 Реконструкция инициаторных и элонгационных
комплексов из очищенных компонентов
7 Количественная обработка результатов
8 РНКтрансфекция
Выводы
Обзор Литературы
Список сокращений.
5НТО 5нетранслируемая область
I лизат ретикулоцитов кролика
МеттРНКиМст инициаторная тРНК, заряженная метионином мРНК матричная РНК
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтиленгликоль
V вирус паралича сверчка от англ. i i Vi
1,4 дитиоЭ,Ьтреитол
этилендиаминтетраацетат
эукариотический фактор инициации трансляции от. англ. i
iiii
V вирус энцефаломиокардита от англ. ii Vi
гуанозин5р,уимидотрифосфат
гуанозин5трифосфат
СТРаза белок, гидролизующий
V вирус гепатита С от англ. ii С Vi
гидроксиэтил1пиперазинэтансульфоновая кислота
I ингибитор рибонуклеаз из плаценты человека от англ.
i iii
белок теплового шока от англ. i
1 участок внутренней посадки рибосомы от англ. i i
i
белковый мотив, узнающий РНК от англ. ii i
V вирус черемуховой тли от англ. i i Vi
додецилсульфат натрия
Т i трисгидроксиметиламинометан.
Введение


Автор диссертации и его коллеги исходили из предположения, что сравнение не только структур рибосом или отдельных факторов трансляции, но и самих механизмов трансляции у бактерий и эукариот может быть весьма полезным для более глубокого понимания этого фундаментального процесса. Подробный анализ этих механизмов позволяет более четко выявить, что же в них является сходным, а что кардинально различным и тем самым сфокусировать внимание исследователей на еще совсем неисследованных проблемах. В данной работе обсуждаются новые примеры, которые показывают очевидное сходство во взаимодействии мРНК с рибосомами бактерий и эукариот млекопитающих. Нами было показано, что внутренняя инициация трансляции для Iэлемента РНК вируса черемуховой тли i i Vi, V возможна не только в бесклеточных системах, но и i viv следовательно, все данные, полученные ранее i vi методом реконструкции инициаторных комплексовиз очищенных компонентов совместно с И. М. Терениным отражают упрощенный способ инициации трансляции, который напоминает инициацию трансляции у прокариот. Основное внимание в диссертационной работе было уделено изучению механизмов инициации трансляции для безлидерных мРНК. Ранее в нашей лаборатории Балакиным и др. С1 мРНК фага А. РНКи в отстутствие факторов инициации трансляции. РНК и одноцепочечной конформацией мРНК непосредственно за инициаторным триплетом. Чтобы приблизиться к пониманию механизма инициации трансляции безлидерных мРНК, который может реализовываться i viv в условиях конкуренции с обычными мРНК и в присутствии полного набора факторов инициации, нами был проанализирован возможный стандартный механизм инициации через образование предынициаторного комплекса. Методом реконструкции комплексов из очищенных компонентов было показано, что фактор инициации оказывает дестабилизирующее влияние на комплекс, собранный на безлидерной мРНК, что делает инициацию трансляции для безлидерной мРНК через связывание с рибосомой предпочтительной. Исследованные нами трансляционные свойства безлидерной мРНК в бесклеточной системе I представили весомые аргументы в пользу того, что в системе, в которой присутствуют все компоненты трансляционного аппарата, для безлидерной мРНК реализуется хотя бы частично фактор независимый механизм инициации через связывание с рибосомой. Таким образом, в данной работе был предложен новый механизм инициации трансляции у эукариот и показана практически полная аналогия в связывании безлидерной мРНК с и рибосомами. Структура и функции рибосомы, ключевого компонента биосинтеза белка, с самого своего открытия привлекают внимание ученых. Действительно, сложно представить себе более фундаментальный процес в клетке, чем синтез полипептида, и более сложно устроенный рибонуклеопротеиновый комплекс, отвечающий вместе со вспомогательными белковыми факторами за выбор инициаторного триплета на мРНК, удлинение полипептидной цепи и ее высвобождение после окончания цикла трансляции. В конце годов в изучении структуры рибосомы был сделан настоящий прорыв увенчались успехом попытки закристаллизовать рибосомную субчастицу из термофильной бактерии i и получить ее рентген с атомным разрешением. В дальнейшем были решены структуры не только отдельных прокариотических рибосомных субъединиц и целой рибосомы, но и комплексов рибосомы с мРНК, тРНК и белковыми факторами. В отличие от прокариотической, эукариотическую рибосому до сих пор закристаллизовать не удалось, однако в последнее время был достигнут значительный прогресс благодаря развитию метода криоэлектронной микроскопии. Сравнивая имеющуюся атомную структуру прокариотической рибосомы со структурой эукариотической рибосомы, полученную методом криоэлектронной микроскопии, можно с достаточно большой степенью надежности выдвигать предположения о структуре последней. Все известные рибосомы выполняют очень похожие функции, и весьма схожи структурно. Однако механизмы трансляции в прокариотах и эукариотах отличаются довольно сильно, особенно на самом сложном этапе, который обычно и определяет уровень экспрессии данной мРНК стадии инициации.