Белково-липидная пора, образуемая колицином Е1 в бислойных липидных мембранах

• Автор: Собко, Александр Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Спонтанная кривизна липидов и е влияние на

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИОННЫХ КАНАЛОВ

1.1.1 Образование тороидальной белковолипидной поры

антимикробными пептидами.

1.1.2 Влияние СК на различные типы ионных каналов

1.2 Влияние толщины мембраны на функционирование ионных

КАНАЛОВ.

1.3 Электростатические взаимодействия на поверхности

МЕМБРАНЫ
1.4 Флипфлоп липидов.
1.5 Влияние липидного состава мембраны на фушшионирование природных каналов.
1.6 Структура и функция белкового токсина колицина Е1
1.6.1 Биологическая роль колицинов
1.6.2 Структура белка и взаимодействие с мембраной
1.6.3 Особенности связывания колицина с БЛМ.
1.6.4 Размер поры в мембране и е структура.
2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Влияние спонтанной кривизны образующих мембрану липидов на каналообразующую активность колицина Е
2.1.1 Мультиканальная активность колицина Е1 на плоских
мембранах
2.1.2 Вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом.
2.1.3 Измерение связывания колицина с БЛМ.
2.1.4 Спонтанная кривизна мембраны и тороидальная модель
2.2 Индукция флипфлопа липидов колицином Е
2.3 Одиночные каналы колицина Е1 в лигшдной мембране
2.3.1 Два состояния проводимости каналов колицина Е
2.3.2 Влияние толщины мембраны на образование одиночных
каналов колицина Е
2.3.3 Влияние С К на канальную активность колицина Е1.
2.3.4 Влияние анионных липидов на проводимость одиночных
каналов колицина Е
2.3.5 Ионная селективность одиночных каналов колицина Е
2.3.6 Оценка размера пС и 0пС каналов.
2.4 Зависимости селективности и проводимости одиночных
КАНАЛОВ КОЛИЦИА Е1 ОТ ЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАНЫ
2.4.1 Изменение ионной селективности каналов при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.
2.4.2 Изменение проводимости одиночного канала колицина Е1 при переходе от нейтральной к отрицательно заряженной мембране.
2.5 Модель образования тороидальной белковолипидной поры К0ЛИЦИН0МЕ
2.6 Влияние ионов кальция на образование каналов под ДЕЙСТВИЕМ колицина Е1 .
2.6.1 Влияние ионов кальция на индуцированный колицином ток через БЛМ
2.6.2 Влияние ионов кальция на связывание колицина с мембраной.
2.6.3 Влияние ионов кальция на одиночные каналы колицина Е1.
2.6.4 Одновременные измерения связывания колицина и его каналообразования с помощью флуоресцентного микроскопа.
2.6.5 Влияние кальция в рамках модели тороидальной поры.
2.7 Фотохимическая и химическая модификация БЛМ и е ВЛИЯНИЕ А АКТИВНОСТЬ колицина Е1
2.7.1 Флуоресценция триптофанов колицина Е1 при химической и фотохимической модификации.
2.7.2 Влияние химической и фотохимической модификации на индуцированный колицином интегральный ток через БЛМ
2.7.3 Активация индуцированной колицином проводимости БЛМ при химическом и фотохимическом воздействии
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЕН АЯ ЧАСТЬ
3.1 Используемые реактивы.
3.2 Используемые методы.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В рамках модели белковолипидной поры можно легко объяснить свойства колициновых каналов, которые необъяснимы с точки зрения модели чисто белковой поры. В настоящей работе изучаются различные аспегсты каналообразования колицина Е1 и на основании полученных данных доказывается, что канал колицина Е1 образуется по механизму тороидальной белковолипидной поры. Биологические мембраны являются важной частью клетки. Они отделяют клетку от окружающей среды, управляют обменом веществ между клеткой и е окружением 1. Также следует отметить, что с мембраной связаны многие клеточные ферменты, играющие важную роль в метаболизме и регуляции работы клетки. На настоящей момент мембрану наиболее часто рассматривают в рамках жидкостномозаичной модели Сингера и Николсона. Согласно этой модели, мембрана представляется как фосфолипидный бислой, в который погружены белки, способные свободно диффундировать в нм. Несмотря на то, что эта модель в последнее время стала подвергаться уточнениям, она до сих пор служит основой для большинства мембранных исследований. Из интересных уточнений этой модели стоит отметить исследования, говорящие о существовании доменов различного состава в пространственноразделенных областях мембраны, а также существование мембраносвязанного цитоскелета. Липидный состав мембран крайне разнообразен, причм причины этого разнообразия до сих пор остаются до конца не выясненными. Из множества липидов различной природы наиболее распространнными являются глицерофосфолигшды. В них одна из гидроксильных групп глицерина связана с полярной головкой остатка фосфорной кислоты, а две другие с гидрофобными остатками жирных кислот. Изза большого разнообразия липидов в живых клетках, в экспериментах часто используют модельные мембраны с заданным липидным составом, что позволяет проводить эксперименты на мембранах с заданными физикохимическими свойствами. Среди бислойных модельных мембран можно выделить 2 основных типа это плоские бислойные липидные мембраны и линосомы. Плоские липидные мембраны формируют в маленьком отверстии между двумя отсеками, заполненными водным раствором. В противоположных отсеках обычно размещают электроды. Такую систем часто используют для изучения электрических параметров БЛМ, в первую очередь ионной проницаемости, индуцированной различными соединениями. В отличие от плоских БЛМ, липосомы, или липидные везикулы, позволяют измерять только интегральную активность каналоформсров. Однако их важным преимуществом является стабильность работать с липосомами можно в течение нескольких дней и простота получения. Как было отмечено выше, одна из важных функций мембраны состоит в осуществлении взаимодействия клеток с внешней средой, что, в частности, выражается в переносе различных ионов и молекул через мембрану. Эту функцию осуществляют находящиеся в мембране переносчики и каналы. Поэтому изучение механизмов действия каналов важно для понимания происходящих в клетке процессов. Известно, что на свойства ионных каналов сильно влияют физикохимические свойства мембраны. Одним из подходов к изучению функционирования каналов является их изучение в модельных мембранах с чтко заданными липидным составом, и, как следствие, физикохимическими свойствами мембраны. Варьируя эти свойства и наблюдая изменения свойств канала, можно попытаться понять механизм функционирования ионного канала. Для нашей работы будут важны следующие свойства БЛМ толщина мембраны, спонтанная кривизна образующих мембрану липидов, поверхностный заряд. В следующих частях Обзора литературы будут подробно рассмотрены как сами свойства БЛМ, так и влияние, которое они могут оказывать на различные типы ионных каналов. Спонтанная кривизна СК липидов может быть определена как соотношение площади поперечного сечения гидрофильной липидной головки к площади поперечного сечения жирного хвоста рис. Принято считать, что липид имеет положительную спонтанную кривизну, если это соотношение 1 например, лизолипид МЛФХ на рис. СК, если эго соотношение близко к 1 ДОФХ, отрицательную спонтанную кривизну, если соотношение 1 ДФФХ или диолеоилглицерол, ДОГ.