Генетический "нокдаун" протимозина альфа методом интерференции РНК

• Автор: Абаева, Ирина Станиславовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список условных обозначений

Введение

1. Интерференция РНК и ее применение в молекулярной биологии обзор

литературы.

1.1. Феномен интерференции РНК.

1.2. Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК.

1.3. Особенности протекания процесса интерференции РНК в клетках млекопитающих.

1.4. Роль интерференции РНК в жизнедеятельности клетки

1.5. Характеристика систем осуществления интерференция РНК в клетках высших эукариот.

1.5.1. Химический синтез

1.5.2. Транскрипция i vi
1.5.3. Получение интерферирующих РНК с помощью фермента i
1.5.4. Экспрессионные векторы.
1.6. Примеры использования интерференции РНК в молекулярной биологии
2. Генетический нокдаун протимозина альфа человека методом интерференции РНК результаты и их обсуждение
2.1. Осуществление протимозин альфаспецифичной интерференции РНК в клетках человека
2.1.1. Конструирование плазмид для осуществления генетического нокдауна протимозина альфа в клетках человека.
2.1.2. Оптимизация условий интерференции РНК протимозина альфа
2.2. Доказательства осуществления генетического нокдауна протимозина альфа методом интерференции РНК.
2.2.1. Оценка снижения количества мРНК протимозина альфа в клетках НеЬа, трансфицированных рЗирегКЫАьРгоТа
2.2.2. Специфичность использованных интерферирующих РНК
2.2.3. Оценка снижения экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта.
2.3. Специфичность эффекта снижения экспрессии гена протимозина альфа
2.4. Исследование участия протимозина альфа в ответе клетки на
окислительный стресс.
3. Экспериментальная часть.
3.1. Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и
реактивы.
3.2. Используемые методы.
3.3. Манипуляции с клетками млекопитающих
3.4. Конструирование плазмид
Выводы
Список литературы


Его первичная структура содержит половину остатков глутаминовой и аспаргиновой аминокислот. Протимозин альфа не имеет какихлибо элементов вторичной и третичной структуры . Несмотря на значительное количество накопившихся к настоящему времени экспериментальных данных, касающихся возможной роли этого белка в жизни клетки, механизм его действия неизвестен. Было показано, что этот белок важен для процесса клеточного деления. Совсем недавно в нашей лаборатории было установлено, что протимозин альфа имеет на Сконце сигнал для узнавания каспазами3 и 7 и является антиапоптотическим белком. Кроме того, посредством дрожжевой двугибридной системы был обнаружен один из молекулярных партнеров протимозина альфа. Им оказался белок Кеар репрессор активатора транскрипции генов ответа на окислительный стресс Ыг2. Цель данной работы заключалась в отработке метода интерференции РК протимозина альфа в клетках человека. Используя этот метод, мы также попытались пролить свет на возможную роль протимозина альфа в механизме ответа клетки на окислительный стресс. Эти исследования,несомненно, важны для понимания основных регуляторных путей молекулярного механизма защиты клетки от окислительного стресса, нарушение которых тем или иным образом может оказаться губительным для клетки. Детали же участия протимозина альфа в процессе регуляции ответа клетки на окислительный стресс, а также его возможное участие в других важных клеточных процессах, очевидно, еще только предстоит выяснить. I
1. По мерс расшифровки первичной структуры генов актуальной для молекулярнобиологических исследований становится проблема регуляции активности этих генов в клетке. Регуляция экспрессии генов может осуществляться на разных уровнях. В последнее время внимание многих исследователей обращено к явлениям регуляции экспрессии генов с помощью взаимного узнавания нуклеиновых кислот друг другом, а именно высокоизбирательного ДНКДНК, ДНКРНК, РНКРНК узнавания. Эти взаимодействия легли в основу создания так называемой антисмысловой технологии, которая открыла принципиально новые возможности в борьбе с вирусными инфекциями и болезнями. Олигонуклеотиды или одноцепочечные полинуклеотиды, взаимодействующие ,со смысловыми, т. Чаще всего такие взаимодействия подавляют биологическую активность нуклеиновой кислоты в клетке. Это происходит за счет ареста трансляции при взаимодействии с мРНК, либо за счет подавления транскрипции при взаимодействии с промоторной областью ДИК ДНКтриплексы, либо за счет стимуляции нуклеазного расщепления мРНК клеточными нуклеазами РНКаза Н или самим олигонуклеотидом рибозимы 2. Однако недавно появился существенно более эффективный метод подавления экспрессии генов, основанный на явлении интерференции РНК. Суть этого явления состоит в следующем введение в клетку двуцепочечных молекул РНК, последовательность которых идентична генумишени, приводит к тому, что уровень экспрессии этого гена значительно падает. Открытие этого явления было связано именно с использованием антисмысловой технологии и первоначально было обнаружено в клетках нематоды ii 3. Мелло и коллеги пытались установить функцию некоторых генов в клетках нематоды ii при помощи антисмысловых РНК, комплементарным соответствующим мРНК, а в качестве контроля ими использовались смысловые РНК, гомологичные данным мРНК. Однако им не удалось зафиксировать значительного падения уровня экспрессии генамишени. Неожиданно оказалось, что введение в клетки смеси смыслового и антисмыслового рибоолигонуклеотидов по крайней мере в раз более эффективно в подавлении экспрессии генов, чем использование смысловой или антисмысловой РНК, взятых по отдельности 3. Ранее было обнаружено, что введение в клетки растений трансгенов часто приводило к быстрой инактивации не только самого трансгена, но и к генетическому молчанию идентичных эндогенных последовательностей ДНК 4,5. Это явление было названо косупрессией, оно было также описано и в других организмах , i и ii . Кроме того, было показано, что заражение растений РНКсодержащими вирусами приводит к быстрой деградации вирусной РНК.