Пептидные производные 5-О-микаминозилтилонолида как инструменты для изучения рибосомного туннеля : дизайн, синтез, биологические свойства

• Автор: Шишкина, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений. в

Введение

Глава 1. Растущий пептид в рибосомном туннеле Обзор литературы

1.1. Строение и функционирование рибосомы.

1.1.1. Морфология бактериальной рибосомы.

1.1.2. Функционирование рибосомы

1.2. Рибосомный туннель

Сайт связывания макролидных антибиотиков

1.3. Взаимодействия растущих пептидов со стенками рибосомного туннеля

1.3.1. Экспрессия генов сси и с1тА

1.3.2. Регуляция экспрессии гена яесА.
1.3.3. Регуляция трансляции белка УЬсЬ
1.3.4. Триптофаназный оперон. Механизм регуляции экспрессии.
Глава 2. Обсуждение результатов. иМЧИНИММЧ мминнч
2.1. Дизайн пептидных производных ОМТ как инструментов для изучения функционирования РТ
2.2. Получение антибиотика 5Омикаминозилтилонолида.
2.3. Разработка метода синтеза аминокислотных и пептидных производных ОМТ по положению С
2.4. Синтез Мзащищенных пептидов, содержащих остатки фенилаланина и триптофана.
2.5. Синтез фенилаланин и триптофансодержащих пептидных производных ОМТ по положению С
2.6. Изучение биологической активности пептидных производных ОМТ по положению
2.6.1. Изучение связывания ОМТ и его производных с рибосомой.
2.6.2. Исследование ингибирующей активности производных ОМТ в системе транскрипциитрансляции зеленого флуоресцентного белка вГР.
2.6.3. Исследование ингибирующей активности производных ОМТ в системе трансляции мРНК люциферазы светлячков
2.6.4. Изучение антибиотической активности триптофансодержащих производных ОМТ
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Исходные вещества и очистка растворителей.
3.1.1. Исходные вещества.
3.1.2. Абсолютирование растворителей.
3.2. Вспомогательные методы
3.2.1. Хроматография в тонком слое.
3.2.2. Препаративная тонкослойная хроматография
3.2.3. Колоночная хроматография
3.2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография
3.2.5. Гидролиз пептидов и аминокислотный анализ.
3.2.6. Массспсктрометрия
3.2.7. ЯМРспектроскопия.
3.3. Методики получения веществ
3.4. Методики биологических испытаний
3.4.1. Буферы и растворы.
3.4.2. Выделение рибосом Е. соН
3.4.3. Химический пробинг
3.4.4. Конкурентное вытеснение радиоактивно меченого ,4Сэритромицина
3.4.5. Система транскрипциитрансляции зеленого флуоресцентного белка СБР
3.4.6. Система трансляции мРНК люциферазы светлячков.
ВЫВОДЫ.1чШ
Список литературы


С другой стороны, изучение комплексов рибосомных субъединиц с макролидами а также с многочисленными антибиотиками других классов важно для понимания молекулярных механизмов антибиотической активности, для выяснения причин устойчивости микроорганизмов к антибиотикам и для рационального конструирования на основе этих знаний новых антибактериальных средств. Целью настоящей работы является дизайн, синтез и изучение биологической активности пептидных производных антнбиотикамакролида тилозинового ряда 5Омикаминозилтилонолнда ОМТ с целью получения нового потенциального инструмента для исследования рибосомного туннеля. Литературный обзор посвящен изучению поведения растущего пептида в РТ и его взаимодействий со стенками туннеля. Глава 1. Рибосома представляет собой крупную рибонуклеопротеидную частицу, которая осуществляет синтез белка процесс трансляции во всех клетках, используя мРНК в качестве шаблона и аминоацилированные тРНК в качестве субстратов. Рибосома является посредником во взаимодействиях между аминоацилтРНК и РНКматрицей, которая определяет аминокислотные последовательности белков. Диаметр бактериальной рибосомы составляет около 0 , примерно на две трети рибосома состоит из РНК, на одну треть из белковых молекул. Рибосомы эукариот отличаются от бактериальных по размерам и но соотношению РНКбелок, но все они состоят из двух неэквивалентных субъединиц большая субъединица примерно в два раза превосходит малую по молекулярной массе. В зависимости от содержания ионов 2 бактериальные рибосомы при аналитическом ультрацентрифугировании седиментируют либо одним ником с коэффициентом седиментации , либо двумя с коэффициентами и . У прокариот малая субъединица состоит из одной молекулы РНК длиной около нуклеотидных остатков рРНК и различных белковых молекул. Большая субъединица содержит РНК, состоящую примерно из нуклеотидных остатков рРНК, РНК из 0 нуклеотидов 5 рРНК и около различных белков. Молекулярный вес типичной прокариотической рибосомы составляет около 2. Да. Эукариотические рибосомы построены по тем же принципал, что и прокариотические, но они крупнее молекулярная масса до 4. РНК. Эукариотическая рибосома состоит из и субъединиц. Общая форма и размеры рибосомы были определены в начале ых гг. С развитием этого метода были охарактеризованы детали морфологии большой, малой субъединиц, а также и рибосомы. Ее длина составляет около 0 А, а ширина около 0 А. Первые электронномикроскопические исследования субъединиц рибосом . А. С началом использования метода реконструкции криоэлектронных микрофотографий частиц, находящихся в одной ориентации 7,8, было достигнуто значительное улучшение разрешения метода, благодаря чему была подтверждена не только общая форма рибосомы, но и выявлены многие детали ее структуры. В х годах активно начали развиваться методы рентгеноструктурного анализа РСА биологических макромолекул, и в году был разработан формат файлов 9 для хранения координат атомов, а позднее была создана международная база данных. Однако, главным препятствием для изучения рибосом методом РСЛ была сложность их кристаллизации и получения однородных кристаллов, большая асимметрия которых не позволяла эффективно использовать кристаллографический подход. Со временем в развитии методов кристаллизации рибосомы ii i был достигнут значительный прогресс см. К настоящему времени с высоким разрешением расшифрованы структуры отдельных субъединиц и рибосом из различных организмов 1,. Из современных данных известно, что основными морфологическими элементами субъединицы являются центральный протуберанец, в состав которого входит 5 РНК и ассоциированные с ней белки , 1 протуберанец и протуберанец, образованный белком 7. Остовом структуры субъединицы служат 5 и рРНК. Кроме того, РСА подтвердил, что большая субъединица содержит туннель, который проходит от центра ее плоской поверхности к противоположной стороне, как ранее и предполагали исследования электронной микроскопии . Также было показано, что пептидилтрансферазный центр расположен в начале туннеля ближе всего к малой субъединице рибосомы Рис. РНК. Одним исключением является белок малой субъединицы , который расположен прямо в зоне контакта между субъединицами своей Сконцевой частью, а его концевая часть пронизывает всю субъединицу и формирует контакты с белками на ее т.