Свойства 5'-нетранслируемой области мРНК белка теплового шока человека HSP70

• Автор: Рубцова, Мария Петровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 110 с. : ил.

1.1. Общая схема инициации белкового синтеза в клетках эукариот

1.2. Внутренняя инициация трансляции

1.3. Инициация трансляции по механизму шунтирования

1.4. Метод поиска Iэлемснтов

1.5. Участки внутреннего связывания клеточных мРНК

1.5.1. Iэлемент мРНК i

1.5.2. Iэлементы мРНК морфогенетических факторов ix и i

1.5.3. Iэлемент мРНК протоонкогена стуе

1.5.4. Iэлемент мРНК

i 1.5.5. Iэлемент мРНК 1X

1.5.6. Iэлемент мРНК

1.5.7. Iэлемент мРНК
1.5.8. Iэлемент мРНК аутоантигена
1.5.9. Iэлемент мР1 I XI
1.5 Iэлемент мРНК
1.5 Iэлемент мРНК 1.5 Iэлемент мРНК
1.5 Iэлемент мРНК 2i
1.5 Iэлемент мРНК V
1.5 Iэлемент мРНК I
1.5 Iэлемент мРНК р
1.5 Iэлемент мРНК протсинкиназы С6 РКС
1.5 Iэлемент мРНК рецептора II
1.5 Iэлемент мРНК
1.5 Iэлемент мРНК орнитиндекарбоксилазы
1.5 Iэлементы других мРНК клеточных белков Iэлемент мРНК
Iэлемент мРНК Iэлемент мРНК 2 Iэлемент мРНК Iэлемент мРНК Iэлемент мРНК x6.1 Iэлемент мРНК I Iэлемент мРНК 5 Т1Р Iэлемент мРНК Сх Iэлемент мРНК Сх Iэлемент мРНК рецептора эстрогена а Iэлемент мРНК v.4 ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Свойства 5 нетранслируемой области мРНК белка тенювого шока человека II
2.1. Особенности инициации трансляции в условиях теплового шока
2.2. Исследование способности мРНК к внутренней инициации трансляции
2.3. Определение границ элемснта мРНК 1I
2.4. Делеционный анализ ЖЕБэлемента мРНК НЗР
2.5. Трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5Ч1ТО мРНК Н8Р ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Плазмидные конструкции, использованные для исследования способности
НТО мРНК НБР к внутренней инициации
3.3. Плазмидные конструкции, использованные для исследования границ I.элемента мРНК 5
3.4. Плазмидные конструкции, использованные для делеционного анализа 1ЯЕ8элемента мРНК НБР
3.5. Клонирование
3.5.1. Рестрикция и выделение фрагмента ДНК в легкоплавкой агарозе
3.5.2. Лигирование
3.5.3. Полимеразная цепная реакция
3.6. Трансфекция клеток и измерение в них активности люцифераз и Ргалактозидазы
3.7. Определение целостности РНК методом защиты от рибонуклеаз
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Iэлемент мРНК I Iэлемент мРНК 5 Т1Р Iэлемент мРНК Сх Iэлемент мРНК Сх Iэлемент мРНК рецептора эстрогена а Iэлемент мРНК v. ГЛАВА 2. Трехмерная модель узнавания инициаторного кодона при инициации трансляции на 5Ч1ТО мРНК Н8Р ГЛАВА 3. Плазмидные конструкции, использованные для исследования границ I. Модель инициации белкового синтеза в клетках эукариот, предложенная М. Козак I, предполагает, что первоначально Б рибосомная субчастица при участии факторов инициации узнает кспструктуру на 5конце мРНК кепструктура представляет собой 7метил гуанозин, соединенный с 5концсвым иуклсозидом трифосфатной связью и связывается с 5концевой областью мРНК рис. Затем Б субчастица начинает скользить вдоль мРНК при содействии инициаторных факторов, расплетающих вторичную структуру 5нетранслируемой области 5НТО мРНК, сканируя ее в поисках А1Юкодона, находящегося в благоприятном для инициации трансляции нуклеотидном контексте. После этого к Б комплексу присоединяется Б рибосомная субчастица, и образовавшийся Б инициаторный комплекс начинает синтез белка. Данная модель механизма инициации трансляции называется кепзависимой или сканирующей. Следует отметить, что даже если мРНК не содержит кепструктуры например, когда она получена с помощью стандартной Т7транскрипции, ее трансляция в лизате ретикулоцитов кролика идет достаточно активно, уступая лишь в раза эффективности трансляции природной кепированной матрицы. В этом случае Б рибосомная субчастица также садится на 5конец моноцистронной . РНК, поэтому данный механизм правильнее называть 5конецзависимым. Согласно этой модели посадка 8 рибосомной субчастицы внутри цепи мРНК принципиально невозможна. Описанная модель предъявляет определенные требования к строению мРНК. Ч1ТО. Инициация трансляции таких мРНК происходит, как правило, на ближайшем к 5концу А1Юкодоне. Рис. Схематическое изображение сканирующей модели инициации трансляции эукариотических мРНК. Впоследствии оказалось, что к ряду мРНК подобный механизм инициации синтеза белка неприменим в силу иного строения их 5НТО. Для таких мРНК была предложена модель внутренней 5конецнезависимой инициации трансляции. В соответствии с этой моделью рибосомная субчастица связывается с внутренним участком 5НТО мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы или Iэлементом i . Vi, который может отстоять от конца мРНК более чем на 0 нуклеотидных остатков. РНК пикорнавирусов 2, 3,4, 5НТО которых не копированы, весьма протяженны, сильно структурированы и содержат до триплетов, предшествующих истинному инициаторному кодону. Впоследствии Iэлсменты обнаружили и в мРНК вирусов других групп. В настоящий момент известно три типа Iэлементов тип I полиовирус кодон отделен спейсером 0 нуклеотидов, тип II V кодон входит в I, тип III гепатит А не активен в составе бицистронной конструкции 5. Белковый синтез на вирусных мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические факторы инициации. Это послужило основанием для предположения, что некоторые клеточные мРНК также способны к внутренней инициации. Список мРНК млекопитающих, содержащих Iэлементы, постоянно растет и в настоящее время включает мРНК, важных для роста, дифференцировки и функционирования клетки 6. Тем не менее, молекулярные механизмы внутренней инициации трансляции клеточных Iэлементов до сих пор неизвестны. Нахождение новых Iэлементов, а также изучение их сгроения и функционирования позволит пролить свет на механизм внутренней инициации трансляции. Для своей работы мы выбрали достаточно простую модель 5НТО мРНК белка теплового шока человека . На основании тщательного анализа литературных данных мы пришли к выводу, что 5НТО мРНК должна обладать способностью к внутренней инициации трансляции не только при тепловом шоке, но и в условиях возврата к нормальной температуре. Действительно в условиях теплового шока подавляется активность кспсвязывающсго инициаторного фактора I4, что приводит к снижению эффективности кспзависимой инициации трансляции.