Структурно-функциональный анализ полипептидных токсинов скорпионов - блокаторов калиевых каналов

• Автор: Королькова, Юлия Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ТОКСИНОВ С КАЛИЕВЫМИ КАНАЛАМИ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Калиевые каналы.

1.3. Иш ибнторы Кканалов и яда скорпионов.

1.3. 1. Структурные особенности токсинов скорпионов бяокаторов К каналов.

1.3.2 Специфичность действия токсинов скорпионов

1.3.3 Механиш действия токсинов скорпионов

1.3.4. Структурная модель К селективной поры.

1.4. Нейротоксины змей и морских анемон.

1.5. Токсины ит яда пчел
1.6. Нсйротоксины пауков новый тип ингибиторов Кканалов.
1.7. к и кАКонотоксинм
1.8. Заключение.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Определение нуклеотидной последовательност и кДНК генов токсинов 0К1 и ВеКт1.
2.1.1. Выделение мРНК.
2.1.2. Клонщнншние фрагментов кДНК генов токсинов ЪК1 и ВеКт
2.1.3. Получение кДНК. содержащей полную кодирующую последовательность гена
токсина ВеКт
2.1.4. Анализ кДНК .хна токсина ВеКт
2.2. Анализ первичной структу ры токсинов ОзК1 и ВсКт
2.3. Экспрессия генов токсинов 5К1 и ВсКпт1 в клетках Е.соН.
2. 3.1. Создание укспресещгупщих конструкций, выделение и очистка рекомбинантных
прозЛуктов4У
2.3 2. Биологическая активность рекомбинантных токсинов 0.К1 и ВеКт1.
2.4. Анализ нространсгвснной структуры ВсКт1.
2.5. Исследование механизма действия токсина ВеКт1.
2.5.1. Действие ВеКт 1 на клониюланные каналы КСК и ЕЯО человека5В
2.5.2. Специфичность действия токсина ВеКпь.
2.6. Определение специфического участка связывания токсина ВсКт1 с ЕЯв
каналом
2.6. 1. Обоснование и выбор мутаций
2.6.2 Сайтчшпртяенный мутагенгг гена и получениерекомбинантных аналогов ВеКт1. 2.6 3. Исследование биологической активности мутантных форм токсина ВеКт1
2.6.3.1. ффегт мутантных анадоюв токсина ВсКт1. содержащих замены в Сконкевой области, на Мтоки в клетках МЛ 8 и каналы ЬЕЯ
2.6.3.2. Действие мутанта АгЬуРЬе1у на Са активируемые Кканалы.
2.6.3.3. Действие Мкомценых мутантов ВсКт1 наЬЕЯО каналы.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Оборудование и материалы
3. . 7. Оборудование .
3.1.2. Реактивы и ферменты.
3.1.3. Бактериальные штамиы и пчачмидные векторы.
3.1.4. Микробиологические среды и растворы.
3.2. Методы
3.2.1. Выделение РНК
3.2.1.1. Выделение тотальной РНК из ядовитых жедез скорпионов
3.2.1.2. Получение роуД РНК
3.2.2. Синтез первой цепи кЩК.
3.2.3. Тешим первой цепи к ДНК.
3.2.4. Амплификации кДНК.
3.2.5. Электрофоре ДНК в агара таи геле.
3.2.6. Расщепление ЛНК ундонуклеаммирестрикции и очистка фрагментов ДНК ы
агароэного геля.
3.2 7. Лигирование фрагментов кННК в .линеаризованный вектор.
3.2.8. Получение и трамаюрмация компетентных кчеток ЕсоИ
3.2.8.1. Трансформация методом гепдового шока
3.2.8.2. Трансформации методом хтсктропораиии
3.2.9. Скрининг колоний Е.соИ. содержащих рекомбинантные молекулы пмпчидной ДНК. с
помощью ПЦР.
3.2 Выделение нлашиднойДНК.
3.2 Секеенирование по методу Сэнгера.
3.2 Компьютерный апаш нуклеотидных и белковых последовательностей.
3.2 Функциональная экспрессия генов в клетках В. со
3 Получение конструкцй для экспрессии генов токсинов ОяК и ВеКт
3 Сайт направленный мутагенез и получение зкспрсссируюших конструкций для мутанты юрм токсина ВсКш1. .
3 Вылелемие гибридных белков с помощью аффинной фромаюграфии
3 Выделение рекомбинантных токсинов
3 Рефшдинг рекомбинантною токсина ОзК
3.2. . .9 электрофоре бежав по методу Лсммли.
3.2 Определение кошрнтрщии беж а.
3.2 Массалсктромстрия чжоллбмлантных токсинов.
3.2 Эжктрофизио.Юьическне исследования.
3 Измерение Мтоко н клетках .
3 Измерение аиалин нечувствительны к Саактивируемых К токов малой проводимости в клетках . .
3 Измерена Са3апиинруемых Крюков большой проводимости в клетках ОНЗ
3 Измерение Ктохов в клетках НвК3
3.3. Структура олигодсюксирнбонуклеотилных праймеров
ВЫ ПОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поэтому поиск новых лигандов, специфично взаимодействующих с малоизученными типами Кканалов. Решение такой задачи позволяет не только приблизиться к пониманию принципов узнавания биомолскул. Данная работа является частью структурнофункциональных исследований полипспгидных компонентов яда членистоногих, проводимых в лаборатории нсйрорсцснторов и нейрорегуляюров ИБХ РАН Цель настоящей работы состояла в клонировании и определении структуры генов поли пептидных токсинов скорпионов, обладающих активностью но отношению к малоизученным типам Кканалов, получении рекомбинантных продуктов экспрессии данных генов в бакзериалыюй системе, установлении пространственной структуры пептидов, а также получении аналогон токсинов, содержащих направленные замены аминокислотных остатков для более легального изучения механизма их взаимодействия с рецептором. Автор выражает глубокую пришательноегь научному руководителю членкорр. РАИ профессору Гришину Г. В., а также к. Плужникову К. А. и кл. Волковой Т. М. за оказанное внимание, руководство, поддержку и помощь в проведении экспериментальной работы. Автор особо благодарен к. Быстрову за синтез олигонуклеотидов, к. НосыревоЙ Е. Д. и к. Филиппову Л. К. за проведение элсктрофизиолошческих исследований по определению биоло ической активности рекомбинантных токсинов, а также всему коллективу лаборатории нейрорсцспторов и НСЙрОрС у. ТЯГОроВ. Дя изучения структуры и механизмов функционирования многочисленных ионных каналов наиболее удобным инструментом исследования ЯВЛЯЮТСЯ небольшие природные молекулы, выделенные из различных ялов. Однако, на протяжении многих лет не было известно ни одного природного токсина, действующего на нейрональные Кканалы. В то время как высоко аффинные лиганды были обнаружены для натриевых, кальциевых и многих лигандоткрываемых каналов, единственным известным блока тором Кканалов оставался тетраггиламмоний, облетающий нсспсцифичным действием. Ситуация изменилась в году с открытием Розвал и др. СепгигоШе похш полипептида, который ингибировал Ктоки в классическом электрофнзиологичсском лкспсрименте на гигантском аксоне кальмара 1. В последующие годы из яда различных животных была выделена целая коллекция пептидов, блокирующих некоторые тины Кканалов. В настоящее время нейротоксины, селективно и специфично ингибирующие К каналы, образуют структурноразнообразную группу от небольших пептидов до достаточно сложных белков. Арх теШега апамин. Дконотоксниы, содержащие аминокислотных остатков, из морских улиток семейства Сонм. Природные токсины нашли широкое применение для фармакологической характеристики Кканалов. Калиевые каналы представляют группу интегральных мембранных белков, образующих высокосслективнме норы в клеточной мембране. В настоящее время они обнаружены практически во всех типах клеток, где им принадлежит ключевая роль в установлении потенциала покоя и проведении биоэлектрических сигналов. Особую роль калиевые каналы выполняют в нейрональных клетках, тле отвечают процессы клеточной возбудимости, регулируя стабилизацию мембранною потенциала нейронов или контролируя выброс нейромедиаторов из нервною окончания. Многообразие биоложческих процессов, н которых принимают участие Кканалы определяет огромное разнообразие типов канатов, различающихся но физиологическим свойствам, клеточной локализации, чувствительности к различным препаратам и токсинам 3. Калиевые канаты могут быть разделены на подклассы но своим биофизическим и фармакологическим свойствам. Кканалы каналы, вероятность открывания которых регулируется внутриклеточными месенлжсрамн, такими как . Д ГФ, Перевязывающие белки, нсиротрансмиттсрахш. К этому семейству относятся С а активируемые Кканалы. V и разделяются в зависимости от проводимости каната на канаты большой ВКканалы. Iканалы и малой канаты проводимости 9. Краткие характеристики основных фармакологических типов к каналов представлены в таблице 1. I. iii i. I V I
i Xi II I II . I iV. II I. I4
. I i 1 V I XVV
. I.III Ixi i 0. Ii I I3. I8
i 3. Vi i . I . I Vi iv ,vi. I i . I ,x .