Влияние димеризации на функциональные свойства пирофосфатаз двух семейств

• Автор: Парфеньев, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 184 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СОКРАЩЕНИЯ И ТЕРМИНОЛОГИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА РАСТВОРИМЫХ ФЕРМЕНТОВ

Обзор литературы

1. Введение

2. Взаимосвязь четвертичной структуры с функцией и стабильностью фермента

2.1 Стабильность молекулы белка

2.2 Сравнение разных олигомерных форм одного фермен т

2.2.1 Диссоциирующие ферменты

2.2.2 Перманентные олигомерные комплексы

2.3 Изофункциональные ферменты
3. Сравнение мономерных ферментов и субъединиц олигомерных ферментов
3.1 Длина ППЦ
3.2 I 1ижний предел длины ППЦ мономерною фермента
3.3 Факторы, определяющие стабильность молекулы белка
3.4 Функции мономерных ферментов
4. Зоны контакта субъединиц
5. Эволюция олигомерных ферментов
6. Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
2. Ферменты
3. Приготовление растворов
4. Определение гидролитической активности пирофосфагазы
5. Определение коэффициентов седиментации
6. Определение молекулярной массы методом седиментациониого равновесия
7. Математическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Неорганическая пирофосфатаэа дрожжей
1.1 Зона контакта субъединиц
1.2 Дестабилизация четвертичной структуры УРРазы
1.3 Влияние мутаций на четвертичную структуру фермента.
1.4 Факторы, контролирующие стабильность олигомерной структуры УРРазы
1.4.1 Влияние ионов Ме на стабильность олигомерной структуры У9БРРазы
1.5 Стабильность четвертичной структуры и подвижность ППЦ
1.6 Влияние олигомерного состояния на каталитические свойства фермента
2. Семейство II растворимых пнрофосфатаз
2.1 Олигомерная структура
2.2 Зависимости активности фсрметгов от их концентрации
2.3 Влияние ионов металлов на активность ферментов
2.4 Необходимость ионов металла для проявления активности
2.5 Субстратная специфичность
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Температуры, при которых i равна нулю, обозначают как температуры Холодовой Т0 и тепловой денатурации Т,д. Тт зависит от концентрации 8. Температуру, при которой i достигает максимальною значения, называют температурой максимальной стабильности Тмс. При Лври 0 половина молекул белка находится в денатурированном состоянии 1. Кривизна зависимости ДОп, ог температуры определяется значением ДСГ изменениетеплоемкости системы в результате перехода белка из нативною в денатурированное состояние при постоянном давлении. Чем меньше ДСР, тем более линейной будет кривая и тем выше будет тсрмостабильность белка Т,,. Для мономерных мезофилытых белков значение ДС,, линейно возрастает с увеличением длины ППЦ. В случае необратимой денатурации, стабильность белка характеризуют величинами Тю время, за которое половина белка переходит в денатурированное состояние при данной температу ре, Т12 температура, при которой инактивируется половина белка за определенное время инкубации и Сиг концентрация денатурирующего агента, при которой денатурирует половина всех молекул белка за определенное время инкубации. При необратимой денатурации весь белок может перейти в денатурированную форму даже при температурах ниже Тт. Кинетическая стабильность белка зависит от соотношения значений констант скорости денатурации к0 и ренатурации кг и консгангы скорости к. II в необратимо денатурированную X схема I. Схема I. V и X
Стабильность структуры белка определяется множеством взаимодействий разной природы. В основном, ото ионные и гидрофобные силы, водородные и лисульфидиые связи. Баланс этих взаимодействий сложным образом зависит от действия различных факторов. Например известно, что с повышением температуры сила ионных взаимодействий возрастает, главным образом, за счет понижения диэлектрической проницаемости воды и уменьшения энергии дегидратации полярных групп. Гидрофобные взаимодействия также усиливаются с повышением температуры, достигая максимума при , и практически сходят на ист выше 0 1,6. Известно, что холодолабильные ферменты, которые инактивируются при низкой температуре в результате диссоциации олигомера иили денатурации мономера, могут быть стабилизированы этнленгликолсм, пропиленглнколем, глицерином или фосфатом. Оказалось, что влияние этих соединений на стабильность белка коррелирует с их эффектом на структуру окружающей воды, вследствие чего эти соединения разделили на космотропы от грсч. Косиотропы взаимодействуют с первым слоем непосредственно примыкающих молекул воды более сильно, а хаотропы менее сильно по сравнению с взаимодействием между собой молекул воды в отсутствие посторонних соединений. Наиболее сильные космотропы имеют наибольший гидродинамический радиус. Другими словами, космотропы более эффективно конкурируют за близлежащие молекулы воды, чем окружающая вода, а хаотропы мснсс эффект ивно. Анионы, расположенные доСГ, являются полярными космотропами они структурируютокружающую воду и стабилизируют белки, а находящиеся после С1 являются хаотропами они нарушают структу ру окружающей воды и дестабилизируют белки. Ионы СГ практически не влияют на структуру воды и. М, на стабильность белка . Известно, что в жидкой воде всегда есть локальные структурированные области, которые непрерывно возникают и распадаются. Действие космотропных и хаотрешных агентов можно объяснить, если предположить, что вода стремиться поддержан, определенное соотношение между беспорядочной и упорядоченной структурами. Хаотропы разрушают структуру окружающей воды, следовательно эта структура образуется более легко, скажем, вокруг космотропов, увеличивая их гидродинамический радиус, или вокруг гидрофобных молекул, увеличивая их растворимость и ослабляя, гидрофобные взаимодействия. Космотропы, наоборот, структурируют воду вокруг себя, следовательно структурированные области становятся болсс нестабильными вокруг гидрофобных молекул, уменьшая их растворимость и усиливая гидрофобные взаимодействия. Аналогично, это приводит к уменьшению гидродинамического радиуса ионов ионы легче дегидратируются.