Диальдегидсодержащие ДНК-дуплексы как реагенты для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз MvaI и EcoRII и эндонуклеазы рестрикции EcoRII

• Автор: Гриценко, Оксана Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с.

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. Днальдегндсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты синтез, свойства, аффинная модификация белков Литературный обзор.

1.1. Введение альдегидных групп в углеводный фрагмент НК

1.1.1. Получение и структура диальдегидных производных нуклсозидов и нуклеотидов

1.1.2. Некоторые химические свойства нериодатокисленыых производных нуклсозидов

1.1.3. Введение днальдегидного фрагмента в олигонуклеотиды.

1.1.3.1. Введение альдегидных групп в концевые нуклеотидные остатки.

1.1.3.2. Введение альдегидных групп в любое положение олигонуклеотидной цепи.

1.2. Аффинная модификация белков и полипептидов периодатокислсннммн производными НК

1.2.1. Ковалентное присоединение белков к диальдегидным производным нуклеотидов

1.2.2. Аффинная модификация белков и полипептидов днальдсгндсодсржащимн олигонуклеотидами
ГЛАВА 2. Диальлегидсодсржащис ДНКдуплексы как реагенты для аффинной модификации ДНК.метилтрансфераз Лга и II и эндонуклеазы рестрикции ЕсоКМ Обсуждение результатов.
2.1. Дизайн днальлезидсодержаших аналогов субстратов для аффинной модификации мстилаз II и v и эндонуклеазы рестрикции xiI .
2.2. Синтез к свойства днальдегндсодержящнх аналогов субстратов
2.3. Взаимодействие диальлегнлеодержашнх ДНКдуплексов с мез платами v и II и эндонуклеазой ЕсоВП
2.3.1. Субстратные свойства диальдегндсодержащкх ДНКдуплексов.
2.3.2. Образование специфических комплексов
2.4. Аффинная модификация ферментов vi I диальлетдеодержашпми ДНКдуплсксами
2.5. Зондирование участков мегилаз v и , взаимодействующих
с диальдегидсодержащими ДНКдуплексамн.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Рсакгнвы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Ферментативное Зфосфорилировапие синтетических олигонуклеотидов
3.3.2. Окисление i и содержащнх олигонуклеотидов
3.3.3. Метилирование ДНКдуплексов .
3.3.4. Гидролиз ДНКдуплсксов эндонуклеазами 1 сЖИ и АШ
3.3.5. Изучение комплексообразования ДНКдуплексов с метил азами соЯ
и Ага и эндонуклеазой ЕсоЯД
3.3.6. Ковалентное присоединение ДНКдуплсксов к ферментам рестрикциимодификации ЛАчй и соЯ
3.3.7. Картирование ковалентных конъюгатов метдлаз Мжй и со1Ш с днатъдегндсодержащими ДНКдуплексами химическими реагентами
3.3.7.1. Подготовка ковалентных конъюгатов к реакциям расщепления химическими реагентами
3.3.7.2. Частичное расщепление ковалентных конъюгатов М.ЛюДНКдуплекс
с помощью НТЦБК
3.3.7.3. Частичное расщепление ковалентных конъюгатов М.Аго1ДНКдуплекс
с помощью ХС.
3.3.7.4. Частичное и исчерпывающее расщепление ковалентных конъюгатов мети лаз Мт и ЕсоШ с диальдегндсодержащими ДНКдуплексамн с помощью ВгСЫ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Лга и II и эндонуклеазы рестрикции ЕсоКМ Обсуждение результатов. Дизайн днальлезидсодержаших аналогов субстратов для аффинной модификации мстилаз II и v и эндонуклеазы рестрикции xiI . Субстратные свойства диальдегндсодержащкх ДНКдуплексов. ДНКдуплексамн. ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Метилирование ДНКдуплексов . Частичное расщепление ковалентных конъюгатов М. Частичное расщепление ковалентных конъюгатов М. ХС. ВЫВОДЫ. Приложение. АМР периодаокислсннос производное 1 . Для обозначения нуклеотидов и аминокислотных остатков олиго и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Между народного союза биохимиков I. Ферменты рестрикциимодификации РМ типа II с высокой специфичностью расщепляют эндонуклеазы рестрикции или метилируют ДНКметилтрансферазы определенные короткие последовательности ДНК. Они выполняют функцию защиты прокариотической клетки от проникновения чужеродной ДНК. Со времени своего открытия ферменты РМ служат важнейшим объектом для изучения природы ДНКбслковых взаимодействий, прежде всего, ввиду своей уникальной специфичности. Особое значение имеет исследование прокариотических мстилаз в качестве модельной системы для выяснения природы биологического метилирования ДНК, которое играет первостепенную роль в процессах транскрипции гонов, канцерогенеза и др. Объектами исследований в настоящей работе являются метилазы соЯ С5метилаза и АЛа1 К4мстилаза, а также эндонуклеаза рестрикции ЕсоЯП, которые узнают в ДНК одну и ту же пятизвенную последовательность 5. ССТОО . Метилазы соШ М. К и А1 М. Ато катализируют перенос метальной группы от кофактора БаденозилЬмелюннна на атомы углерода С5 М. ГсоЯН или на атомы азота 4 М. АЛа внутренних остатков цитозина в этой последовательности. Эндонуклеаза рестрикции соЯ Я. К в присутствии ионов магния гидролизует фосфодиэфнрные связи участка узнавания в положениях, указанных стрелками. Специфическое узнавание ДНК ферментами РМ включает образование контактов между аминокислотными остатками белков и гетероциклическими основаниями и фосфатными группами ДНК. ДНК. Для ЯЕсоМ сделала попытка определить участки связывания ДНК путем экстраполяции данных по связыванию с ДНК всех составляющих эндонуклеазу . II пептидов на полноразмерный белок 1. В отсутствие рентгснострукгурного анализа РСА этих ферментов существует сравнительно небольшое число методов, позволяющих определять участки в белках, взаимодействующие с ДНК. Эффективным методом является аффинная модификация ферментов модифицированными ДНКдуплексами с последующим определением участков белков, образующих контакты с ДНК. Чаще всего для аффинной модификации ферментов используются ДНКдуплексы, содержащие фотоактивируемые аналоги гетероциклических оснований. Перспективной является разработка методов аффинной модификации ферментов аналогами ДНК, содержащими активную группу в углеводофосфагном остове. Диальдсгидныс производные нуклсозидов и нуклеотидов, а также тРНК. Зконце, широко используются для аффинной модификации ферментов, кофакторами или субстратами которых являются нуклеозндгрифосфаты. РНКсинтетаз, соответственно. Однако для ДНКсвячывающих белков такой метод не разработан. Целью работы является разработка нового метода аффинной модификации ДНКметпрансфераз и эндонуклеаз рестрикции на основе днальдепдеодержащих аналогов субстратов. ДНКдуплексов аналогов субстратов ферментов РМ ЕсчДШ и метилазы Ма1 с направленно введенными альдегидными группами 2 исследование субстратных свойств диальдегидсодержащих ДНКдуплексов и их способности специфически связываться с изучаемыми ферментами 3 разработка
реакции ковалентного присоединения диальдегидсодержащих аналогов субстратов к мстилазам соЯ и v и эндонуклеазе со1Ш 4 зондирование участков мегилаз соШ1 и АусЛ, взаимодействующих с ДНК. Работа содержит литературный обзор, в котором рассмотрены получение, структура, химические свойства днальдегндных производных нуклеиновых кислот и аффинная модификация белков с помощью таких производных.