Использование инструментальных микрометодов анализа для постадийного контроля процесса получения рекомбинантного инсулина человека

• Автор: Сергеев, Николай Валентинович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1.СТРУКТУРА ИНСУЛИНА

2. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

2Л. Полный химический синтез

2.2. Полусннтетнческнн

2.3. Биотехнологический.

2.3.1. Двухцепочечный метод.

2.3.2. Метод получения инсулина человека через природный предшественник прочпеулин

2.3.3. Метод получения инсулина человека через секретируемый предшественник в дрожжах .vi

3.ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИНСУЛИНА.

4. КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ГЕННОИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА.

5. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА СУБСТАНЦИИ ИНСУЛИНА
5.1. Требовании к чистоте и подлинности инсулина.
5.2. Гельфильтрация.
5.3. Электрофорез в полиакриламидном геле
5.4. Обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.
5.4.1.Влияние природы и буферного раствора
6.2.2.Механизм удерживания и способ элюирования
5.4.3. Природа органического модификатора
5.4.4. Тин стационарной фазы.
5.4.5. Влияние температуры колонки.
5.5. Капиллярный электрофорез
5.5.1. Природа и буферного раствора.
5.5.2. Приложенное напряжение
5.5.3. Влияние типа и длины капилляра
5.6. Заключение
6.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
6.2. Приготовление буферных растворов
6.3. Приборы и оборудование
6.4. Пробоподготовка и методики проведение анализов
7.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
7.1. Исследование кинетики рснатурацни гибридного белка.
7.2. Анализ чистоты гибридного белка
7.3. Исследование кинетики и механизма реакции трпнсннолиза гибридного белка
7.3.1. Исследование механизма реакции тринсиполиза гибридного белка.
7.3.2. Исследование кинетики тринсиполиза гибридного белка.
7.4. Подтверждение подлинности первичной структуры гибридного белка.
7.5. Исследование процесса выделения ДАвАв1шсулнна и Ав1шсулпна из реакционной массы.
7.6.Исслсдоваиие кинетики расщепления диА,шАвш1сулина карбокенпептндазой В
7.7. Анализ чистоты инсулина н оценка эффективности его очистки методом ионообменной хроматографии
7.8.ИдсТифнкацня примесей в ГИИЧ
7.8.1.Определение содержания дезалтдоА.V1 инсулина.
7.8.2. Определение содержания диЛгАгинсулина, Аг
иисулина и дезамидоАвп4 1инсулина
7.8.3.Определение содержания дезамидоАхпвзинсулина методом
7.8.4.Определение содержания дезамидоинсулинов методом АЭФ 7.8.5. Определен не содержан ия дез гв 0инсулина,.
7.9.Г1одтверждсние подлинности первичной структуры инсулина.
7Псптидгос картирование производных инсулина методом капиллярного электрофореза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью диссертационной работы являлась разработка эффективного постадийного контроля производства генноинженерного инсулина человека ГИИЧ с помощью комплекса инструментальных микрометодов разделения микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии микроОФВЭЖХ, капиллярного электрофореза КЭФ и методов качественной идентификации массспсктрометрии МС. СТРУКТУРА ИНСУЛИНА. Аминокислотная последовательность инсулина человека и большинства млекопитающих хорошо известна 2. Все инсулины состоят из двух полипептидных цепей Ацепь аминокислотный остаток, Вцепь, соединенных двумя дисульфидными связями 7 7 и 2 I9. Еще одна дисульфидная связь является внутрицепочечной, и соединяет 2 остатка в Ацспи 6 . Первичная структура гормона достаточно консервативна рис. Свиньи . БыльV. Кролик . Овиа V . Человек IViIIVii. Человек . Vii. VIi. V.. Свиньи . Рис. Структура инсулина человека и некоторых млекопитающих. Наиболее близкими по своей структуре к инсулину человека являются инсулины свиньи и кролика, у которых в Вцепи вместо Тйгв содержатся аланин и серии, соответственно. Однако, до появления ГИИЧ для инъекций при сахарном диабете использовались, главным образом, инсулины свиньи и быка, получаемые экстракцией из соответствующих панкреатических желез. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА. Полный химический синтез. Химический синтез ИЧ впервые был осуществлен в г 3, однако не мог быть использован в промышленных масштабах, так как включает около 0 стадий пептидного синтеза, что является экономически не выгодным. Полуспнтетичсскнй. Полусинтетический метод получения ИЧ включает химическую трансформацию инсулина свиньи замену Сконцсвого А1аВ на 3 в присутствии трипсина и избытка третбутилового эфира 4. До появления ГИИЧ метод применялся для промышленного производства ИЧ компанией V i Дания. Биотехнологический. Биотехнологический метод получения ИЧ основан на культивировании рекомбинантных штаммов . Двухцепочечный метод. Первым методом получения ГИИЧ, который был реализован в лабораторном масштабе 5, а затем успешно масштабирован для промышленного производства 6, был двухцепочечный метод. США, Л и Вцепи инсулина, соединенные через концевой метионин с фрагментом бактериальной ргалактозидазы, синтезировались в отдельных ферментационных процессах с использованием двух рекомбинантных штаммов . Основной стадией, определяющей выход активного гормона, являлся процесс рекомбинации А и В цепей. С появлением метода получения ГИИЧ через проинсулин, двухцепочечный метод, вероятно, больше не используется для промышленного получения ИЧ изза сложности реакции рекомбинации цепей и необходимости работать с двумя штаммами и, соответственно, с двумя технологическими линиями. Метод получения инсулина человека через природный предшественник про инсулин. Этот метод получения ИЧ является наиболее экономически эффективным в настоящее время 7. В рекомбинантных штаммах . ГБ, т. Пространственная структура проинсулина обеспечивает предпочтительное замыкание дисульфидных связей в положениях, соответствующих нативной структуре инсулина, поэтому замыкание дисульфидных связей проводят, как правило, после отщепления лидерного фрагмента 9. ГБ, что позволяет исключить стадию получения проинсулина и, таким образом, снизить технологические потери. В результате триптического расщепления ренатурированного предшественника с последующей или одновременной обработкой карбоксипеитидазой В образуется инсулин, полностью идентичный природному гормону. Метод получения инсулина человека через секретируемый предшественник в дрожжах . В г. Метод получения ГИИЧ, использующий этот подход, включает в себя стадию культивирования колонии рекомбинантных дрожжей . Укороченный предшественник инсулина экспрессируется в дрожжах с правильно замкнутыми дисульфидными связями ,, что существенно упрощает технологическую схему получения инсулина, однако использование бактериальных штаммовсуперпродуцентов остается экономически более предпочтительным благодаря более высокому уровню экспрессии инсулина в составе ГБ 7. Инсулин человека имеет молекулярную массу Да и занимает промежуточное положение между белками и пептидами. Изо электрическая точка инсулина равна 5.