Исследование структуры и мембранолитического действия пороформирующих токсинов актиний

• Автор: Монастырная, Маргарита Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 269 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ

2.1. Мишени действия мембраноактивных белков и пептидов

2.2. Классификация пороформирующих токсинов ПФТ

2.3. Основные ступени порообразования

2.4. аПороформирующие токсины.

2.4.1. Колицины бактерии ii i.

2.4.2. Апоптотические белки Вах и x семейства Вс белков,

ключевых регуляторов апоптоза .

2.4.3. Дифтерийный токсин ДТ из i ii.

2.4.3.1. Некоторые биохимические аспекты действия ДТ.
2.4.3.2. Основа структурнофункциональных взаимосвязей ДТ
2.4.4. Актинопорины высокомолекулярные цитолизины актиний Ий
2.4.4.1. Классификация цитолизинов актиний.
2.4.4.2. Первичная структура актинопоринов.
2.4.4.3. Вторичная и третичная структуры актинопоринов.
. Исследование конформационного состояния актинопоринов
2.4.4.5. Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами
мембран
2.4.4.6. Исследование механизма олигомеризации актинопоринов.
2.4.4.7. Исследование взаимодействия актинопоринов с мембранным интерфейсом, фосфохолиновый сайт связывания.
2.4.4.8. Молекулярный механизм порообразования.
2.5. Пороформирующие токсины.
2.5.1. Стафилококковый агемолизин из .
2.5.2. Холестеринзависимые цитолизины ХЗЦ грамположительных бактерий.
2.5.2.1. Перфринголизин О из ii i и родственные ХЗЦ
2.5.2.2. Сайт связывания ХЗЦ с мембранным холестерином.
2.5.2.3. Механизм мембранолитического действия ХЗЦ.
2.5.2.4. Влияние холестерина на олигомеризацию и литическую
активность ХЗЦ.
2.5.2.5. Биохимические эффекты ХЗЦ.
2.5.3. Гидрализины новая группа ПФТ гидр семейства ii.
2.6. Пороформирующие антимикробные пептиды.
2.6.1. Биологическая роль и классификация
2.6.2. Механизм мембранотропного действия
2.6.3. Дсрмасептины
2.6.4. Мелиттин
2.6.5. Аламетицин
2.7. Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования
цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов
2.7.1. Структурная организация бислоя и функциональная роль липидных микродоменов.
2.7.2. Модуляция изменений цитоскелета клетокмишеней бактериальными патогенами.
2.7.3. Сравнительная характеристика структурных особенностей водорастворимых мембраноактивных белков и пептидов и мембранных белков цитоплазматических мембран.
2.7.4. Локализация и роль остатков ароматических аминокислот в
связывании с мембранным интерфейсом
2.7.5. Движущие силы фолдинга мембраноактивных пептидов и белков, взаимодействующих с мембраной
2.8. Перспективы исследования ПФТ и антимикробных пептидов
2.9. Заключение.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
3.1. Введение.
3.2. Поиск цитолизинов в актиниях тропических и дальневосточных морей
3.3. Выделение и очистка цитолизинов актиний
3.3.1. Высокомолекулярные i цитолизины И группа.
3.3.2. Низкомолекулярные i цитолизины I группа
3.3.3. Высокомолекулярные i цитолизины II группа
3.3.4. Высокомолекулярный iiiцитолизин IV группа
3.4. Физикохимические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний
3.4.1. Высокомолекулярные i цитолизины
3.4.2. Низкомолекулярные i цитолизины и .
3.4.3. Высокомолекулярные i цитолизины.
3.4.4. Высокомолекулярный ii цитолизин.
3.5. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на модельные мембраны.
3.5.1. Влияние i цитолизина XЛ и ii цитолизина
на проницаемость липосом.
3.5.2. Порообразующее действие i, i, ii цитолизинов на бислойные липидные мембраны БЛМ
3.5.2.1. Высокомолекулярные i цитолизины
3.5.2.2. Высокомолекулярные i цитолизины
3.5.2.3. Низкомолекулярный i цитолизин .
3.5.2.4. Метридиолизин из ii i.
3.6. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на биологические мембраны
3.6.1. Действие цитолизинов Ий, 1й и IVй групп на эритроциты
млекопитающих
3.6.2. Действие i цитолизина X на яйцеклетки морского ежа
ii.
3.6.3. Изучение проводимости изолированного фрагмента эритроцитарной мембраны, индуцированной цитолизином XЛ
3.6.4. Влияние цитолизина X II на развитие ооцитов морского ежа ii
3.7. Исследование липидной специфичности и липидбелкового взаимодействия i цитолизинов методом дифференциальной сканирующей калориметрии
3.8. Установление первичной структуры i и i цитолизинов.
3.8.1. Определение частичной аминокислотной последовательности i цитолизинов А и и i цитолизинов X, X II
и методами структурной химии белка.
3.8.2. Установление полной аминокислотной последовательности А и .
3.8.3. Установление полной аминокислотной последовательности X
3.8.4. Установление полной аминокислотной последовательности X II.
3.9. Исследование вторичной структуры и конформационной стабильности актинопорина X II.
3.9.1. Пространственная организация нативного актинопорина X II
3.9.2. Влияние различных факторов на конформацию актинопорина X II
3.9.3. Влияние температуры, величины и ионной силы раствора на гемолитическую активность X II
3 Анализ структурнофункциональных взаимосвязей i и i актинопоринов.
3 i актинопорины как инструмент количественного
определения сфингомиелина в биологических жидкостях и тканях.
3 Заключение
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В результате рефолдинга молекулы спираль а9 освобождается из белкового кора, и ее Сконцевой фрагмент становится способным включаться в митохондриальную мембрану . Предполагается, что гидрофобный карман является сайтом связывания антиапоптотических белков с ВНЗ доменом проапоптотических . Рис. Ориентация Сконцевой спирали а9 в гидрофобном кармане белкового кора молекулы Вах . Экспонированные в растворитель боковые цепи а. З.1. Одним из наиболее хорошо изученных к настоящему времени бактериальных аПФТ является дифтерийный токсин из бактерии С. ИрЫкепае. Исследование его поражающего действия показало, что он обладает цитотоксичностью, нарушает морфологию клеток, а также вызывает полное прекращение белкового синтеза в таких клетках, как НеЬа . Успехи, достигнутые в середине прошлого столетия в культивировании долгоживущих клеточных культур и в изучении клеточных процессов, позволили изучить действие ДТ на многих линиях клеток . ДТ эукариотический фактор элонгации 2 ЕР2, 0 кДа, функция которого заключается в удлинении полипептидной цепи на рибосоме . С помощью радиоактивно меченого НАД было установлено, что ДТ катализирует перенос АДФрибозной части молекулы НАД к молекуле ЕР2 рис. Исследование механизма инактивации ЕР2 токсином показало, что АДФрибоксилированию подвергается посттрансляционно модифицированный а. ЕР2. Его физиологическая функция до сих пор не ясна. Предполагается, что АДФрибоксилирование дифтамида играет роль механизма, регулирующего нормальные физиологические клеточные процессы . X Х Рис. I ЕР2 I У I ЕР2 I х ми фактора элонгации ЕР2 . К рибоксил, Р фосфат. З.2. Исследованию структурнофункциональных взаимосвязей ДТ было посвящено значительное количество работ задолго до установления его первичной структуры и получения кристаллической формы. Так еще в году было обнаружено, что ДТ секретируется в неактивной форме , затем в году было показано, что Ыконцевой фрагмент молекулы 3 а. А, проявляет АДФрибоксилтрансферазную активность, в то время как Сконцевой фрагмент В 2 а. Установлено, что А и В фрагменты соединены, помимо пептидной, также дисульфидной связью. Протеолитическое расщепление пептидной и восстановление дисульфидной связей активирует фрагмент А и способствует проявлению его ферментативной функции в цитозоли клетокмишеней . В настоящее время АВ мотив считается универсальным практически для всех внутриклсточно действующих ПФТ бактерий. Кристаллографический анализ структуры ДТ показал, что молекула состоит из трех доменов, имеющих различные фолды, ар типа С, аспирализованного пучка Т и Рбарреля Я, которые соответствуют трем основным функциям токсина каталитической, транслоцирующей и рецепторсвязывающей рис. А 6. Домен С соответствует фрагменту А, а домены Т и Я фрагменту В. АКонцевой каталитический домен С состоит из нескольких аспиралей и Рстрендов. Его активный сайт расположен в расщелине между двух половинок домена. Структура изолированного домена С позволила провести детальный анализ субстратсвязывающего сайта . Эндогенный динуклеотид, Арир, связанный аффинно с доменом, действует как аналог НАД . Домен С это та часть молекулы ДТ, которая после кислотной активации молекулы переносится в цитозоль доменом Т. Чувствительная к действию трипсина гибкая петля, соединяющая домены С и Т, в кристаллической структуре не обнаруживается. Установлено, что во время транслокации домена С через эндосомальные мембраны, которая происходит вслед за активацией, дисульфидная связь восстанавливается, что приводит к высвобождению каталитического домена в цитозоль . С помощью УФспектроскопических исследований показано, что включение домена Т в эндосомальную мембрану запускается снижением величины среды до четырех и сопровождается его рефолдингом . Процессы транслокации и их зависимость от
Рис. А Ленточная диаграмма ДТ 6 активный сайт в каталитическом домене С содержит эндогенный динуклеотид Арир Б Домен Т состоит из девяти аспиралей, ТМ регион домена, образованный гидрофобной шпилькой, окрашен черным цветом. Рисунок выполнен с помощью программы МОЬБСЯЛРТ.