Стратегия биокаталитического синтеза модифицированных пептидов-ингибиторов протеиназ

• Автор: Потетинова, Жанна Вячеславовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Ингибиторы тромбина и плазмина.

1.1.1. Тромбин и плазмин ключевые ферменты

системы гемостаза.

1.1.2. Природные ингибиторы ферментов системы

гемостаза.

1.1.3. Бифункциональные синтетические ингибиторы тромбина.

1.1.4. Сайтнаправленные синтетические ингибиторы тромбина.

1.1.5. Ингибиторы плазмина.

1.2. Стратегии синтеза пептидилааминоальдегидов.

1.2.1. Химические способы получения ааминоальдегидов.
1.2.1.1. Восстановительные методы получения ааминоальдегидов.
1.2.1.2. Окислительные методы получения ааминоальдегидов.
1.2.1.3. Ферментативные методы синтеза ааминоальдегидов дегидрированием 3аминоспиртов.
1.2.2. Методы синтеза пептидилааминоальдегидов.
1.2.2.1. Конденсация производных ааминоальдегидов с эфирами Изащищенных аминокислот и эфиров.
1.2.2.2. Получение пептидилааминоальдегидов через
пактам аргинина.
1.2.2.3. Твердофазный синтез пептидилааминоальдегидов.
1.2.2.4. Получение пептидилааминоальдегидов через
через модифицированные пептиды или производные пептидов.
II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
.1. Ферментативный синтез модифицированных пептидов.
.1. Выбор условий проведения ферментативного синтеза.
II. 1.1. Ферментативный синтез пептидилраминоспиртов.
.1.1.1. Синтез трипептидилраминоспиртов.
II. 1.1.2. Синтез дипептидилраминоспиртов.
II. 1.1.3. Препаративный синтез трипептидилРаминоспиртов.
.1.1.4. Гидролиз пептидилраминоспиртов. катализируемый субтилизином .
.1.1.5. Окисление пептидилраминоспиртов
в соответствующие пептидилааминоальдегиды.
4.1.2. Синтез пептидилааминоальдегидов через защищенные ааминоальдегиды.
.1.2.1. Синтез ааминоальдегидов с защищенной альдегидной функцией.
И.1.2.2. Ферментативный синтез семикарбазонов пептидилааминоальдегидов.
.1.3. Заключение.
.2. Ингибирование сериновых протеиназ пептидилраминоспиртами и пептидилааминоальдегидами.
.2.1. Ингибирование субтилизина и химотрипсина.
.2.2. Ингибирование сериновых протеиназ системы гемостаза тромбина и плазмина.
.2.3. Исследование ингибирующей активности 2А1аА1аАгда1 и РогАаРбеува в плазме.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1.1. Материалы и методы.
1.2. Синтез исходных соединений.
III. 2.1. Синтез фенилаланинола.
III. 2.2. Синтез триптофанола.
1.2.3. Синтез 2Агдо.
1.2.4. Синтез .у5о.
1.2.5. Окисление раминоспиртов.
1.2.5.1. Получение 1РЬеа1.
1.2.5.2. Получение 2РЬеа8ет.
1.2.5.3. Синтез РЬеает.
1.3. Ферментативный синтез модифицированных пептидов.
1.3.1. Приготовление субтилизина , сорбированного на поверхности силохрома.
1.3.2. Построение типичных кинетических кривых ферментативного синтеза пептидилраминоспиртов.
1.3.2.1. Синтез 2А1аА1айеиРйео1 аналитический опыт.
1.3.2.2. Синтез 2А1аА1аР5ео1 аналитический опыт.
1.3.3. Препаративное получение пептидилраминоспиртов.
1.3.3.1. Синтез 2А1аА1аЬеиРЬео1.
1.3.4. Ферментативный синтез семикарбазонов пептидилааминоальдегидов.
1.3.4.1. Построение кинетических кривых ферментативного синтеза семикарбазонов пептидилааминоальдегидов.
1.3.4.2. Ферментативный синтез 2А1аА1аРеает.
1.4. Окисление пептидилраминоспиртов смесью ДМСОАсгО.
1.5. Удаление ацетилацетоном защитной группы с альдегидной функции семикарбазонов пептидилааминоальдегидов.
1.6. Исчерпывающее окисление пептидилааминоальдегидов пепрманганатом калия.
1.7. Основные методики для оценки ингибирующей активности модифицированных пептидов.
1.7.1. Типичная методика гидролиза синтезированных пептидилраминоспиртов, катализируемого субтилизином .
1.7.2. Определение активности сериновых протеиназ.
6
.7.3. Типичная методика ингибирования субтилизина.
1.7.4. Типичная методика ингибирования тромбина.
1.7.5. Типичная методика ингибирования плазмина.
1.7.6. Определение кинетических параметров при ингибировании ферментативной реакции
гидролиза хромогенных субстратов.
1.7.7. Определение типа ингибирования
ферментативной реакции.
II 1.7.8. Определение ингибирующей активности и в плазме крови.
III. 7.8.1. Ингибирование плазмина.
III. 7.8.2. Ингибирование тромбина в присутствии плазмы.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Он захватывает эритроциты, тромбоциты и другие компоненты крови, в результате чего образуется тромбоцитарная пробка. Функция тромбина, помимо превращения фибриногена в фибрин, заключается в переводе факторов коагуляции V, VIII и фактора XIII, стабилизирующего фибрин, в активную форму V, Vi, X, а также в инициации антикоагулянтных путей через активацию протеина С 4. Так как тромбин участвует в таких расходящихся дивергентных биорегуляторных процессах, ингибирование его активного центра должно быть очень эффективным при лечении различных заболеваний. Рис. Дополнительные действия сайтнаправленных ингибиторов тромбина . Целенаправленное воздействие на тромбин или плазмин способно стимулировать лечение тромбозов и геморрагий. Система свертывания крови в норме находится в динамическом равновесии, при котором фибриновые сгустки постоянно образуются, а затем растворяются. Плазмин представляет собой сериновую протеиназу, способную гидролизовать фибриноген и фибрин, а также целый ряд других ферментов, в том числе факторы свертывания, некоторые компоненты комплемента и различные полипептидные гормоны 8. Центральная роль тромбина и плазмина в регуляции агрегатного состояния крови подталкивает многих ученых к попытке создания сильных и селективных ингибиторов данных протеиназ. Некоторые результаты этих исследований суммированы в настоящем обзоре. Природные ингибиторы ферментов системы гемостаза. В плазме крови существует порядка шести различных высокомолекулярных ингибиторов тромбина 2. Они являются наиболее быстро действующими компонентами противосвертывающей системы. Так как эти соединения находятся в активной форме, а не в виде предшественников, их называют прямыми антикоагулянтами. Наиболее изученным из них является гепарин, который препятствует действию тромбина на фибриноген и тормозит превращение протромбина в тромбин 9. По структуре гепарин следует относить к гликозамингликанам. Он предотвращает свертывание крови как i vi, так и i viv, и часто используется в клинической практике . Главным фактором, определяющим противосвертывающую активность гепарина, является активация им антитромбина III белка, который в свою очередь ингибирует сериновые протеиназы. Антитромбин III обладает незначительной эндогенной активностью и сильно активируется в присутствии гепарина. Гепарин, несущий большой отрицательный заряд, связывается со специфическим катионным участком антитромбина III, вызывая конформационное изменение его молекулы рис. Рис. Схематичная диаграмма взаимодействий тромбина с фибриногеном, гирудином и антитромбин Шгепариновым комплексом 2. В результате этого изменения антитромбин III приобретает возможность взаимодействовать практически со всеми сериновыми протеиназами, включая трипсин, химотрипсин и плазмин. В системе свертывания крови антитромбин III ингибирует активность тромбина, факторов IX, Ха, Х1а и ХИа. Наиболее сильным природным ингибитором тромбина является гирудин, найденный в слюне медицинских пиявок i iii , . Он состоит из одноцепочечной полипептидной цепи, включающей аминокислотных остатков, стабилизированных в характерной конформации тремя дисульфидными мостиками. Ряд аналогов этого белка был получен рекомбинантно. Гирудин специфично взаимодействует в обоих каталитических центрах тромбина с i 2. М . Сконец с анионным участком связывания, узнаваемым фибриногеном рис. Таким образом, контактируя с этими двумя участками, гирудин маскирует каталитический центр фермента, тем самым ингибируя расщепление фибриногена и свертывание фибрина. Однако пиявки продуцируют не одну форму гирудина. В литературе описано большое число форм, и все те, которые изучали, оказались сильными ингибиторами. Например, в настоящее время из различных образцов пиявок iii ii выделен гируллин П . Туг в Зю области. Именно эти положения, отличающие последовательность гируллина П, являются важными для связывания гирудина, выделенного из пиявок i iii. На основании этого можно предположить, что гируллин взаимодействует с тромбином несколько иначе, чем гирудин.