Изучение функциональных свойств химозина теленка и его рекомбинантных форм

• Автор: Старовойтова, Виолетта Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ХИМОЗИНА ГЕЛЕНКА.

1.1 Первичная структура химозина. Изоформы фермента

1.2 Субстратная специфичность химозина

1.2.1 Расщепление белковых субстратов

.2 Расщепление пептидных субстратов

1Л Взаимодействие химозина с ингибиторами

1.4 Пространственная структура химозина

1.4.1 Общая характеристика пространственной структуры

1.4.2 Активный центр химозина

1.4.3 Связывание субстрата в активном центре фермента

1.4.4 Сравнение пространственной структуры химозина и других аспартатных протеина
1.5 Механизм действия аснарзагных нрогеиназ
1.6 Сайт специфический мутагенез химозина
1.7 Получение химозина с помощью рекомбинантных ДНК
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1 Выделение химозина и сю рекомбинантных форм
2.2 Свойства химозина теленка и его рекомбинантных форм
2.2.1 Физика химические характеристики ферментов
2.2.2 Гидролиз белковых субстратов гемоглобина.
бычьего сывороточного альбумина, казеината натрия
2.2.3 Гйдролиз пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными фирмами
2.2.3.1 Фяуорогенные субстраты химозина теленка
2.2.3.2 Компьютерное моделирование комплексов химозина теленка с флуорогенными субстратами
2.2.3 3 йдролиз флуорогенных субстратов рекомбинантными химозинами
2.2.3.4 Гидролиз субстрата 1.еиЯегРеМеАиеРгоКНг химозином теленка, трансгенным химозином и химозином Махгеп
2 2.3.5 Ингибирование химозина теленка и его рекомбинантных форм
пепстатином
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Методы исследования. Сорбенты
3.2 Выделение химозина теленка и ею рекомбинантных форм
3.2.1 выделение химозина теленка из препарата сычужного фермента
3.2.2 Выделение трансгенного химозина из молока транс генных овец
3 2.3 Выделение рекомбинантного химозина из препарата Мах1геп
3.3 Изучение свойств химозина теленка и его рекомбинан тных форм
3.3.1 Определение рНзаеисимости протеалитической активности по расщеплению гемоглобина
3.3.2 Упределение рНзависимости протеолитической активности трансгенного химозина по расщеплению бычьего сывороточного альбумина
3 3.3 Активность ферментов по расщеплению казеината натрия
3 3.4 Определение тирозиноаого эквивалента
3.3.5 Определение зависимости устойчивости ферментов от
3.3.6 Определение зависимости активности ферментов от температуры
3.4 Изучение пиролиза пептидных субстратов химозином теленка и его рекомбинантными формами
3.4.1 Гидролиз флуорогенных субстратов
3.4.2 Определение начальных скоростей гидролиза субстратов
3.4.3 Определение зависимости начальных скоростей гидролиза субстратов от концентрации химозина
3.4.4 Влияние на начальные скорости гидролиза субстратов
3.4.5 Определение кинетических параметров гидролиза субстратов
3.4.6 Определение положения связи, расщепляемой химозином во флуорогенных субстратах
3 4.7 Влияние ДМФА на расщепление химозином флуорогенных субстратов
3.4.8 Гидролиз флуорогенных субстратов рекомбинантными формами химозина
3.4 9 Гидролиз флуорогенных субстратов аспергиллопепсином
3.5. Гидролиз субстрата 1,еиегРЬеМс1Л1аеРго.Н2 химозином теленка, трансгенным химозином, химозином Махзгеп
3.5 Ингибирование химозина теленка и ею рекомбинантных форм
пепстатнном
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Фольтмакн 6 с помощью хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе показал, что кристаллический химозин состоит, по крайней мере, из трех различных компонентов, которые он обозначил как А, В, С в порядке снижения молокосзвораживающсй активности. Аналогичные результаты были получены позже при на колонке 7. Однако даже с помощью не удастся хорошо разделить химозины А и В. Основным компонентом является химозин В. Вначале считали, что фракция С представляет собой смесь, частично включающую продукты расщепления. Однако оказалось, что если проводить хроматографию сразу после активации прохимозина. С компонент имеет такую же молокоствораживающую активность как и химозин В. Относительно низкую концентрацию Сформы в препарате химозина Данлей 8 объясняет наибольшей неустойчивостью этого компонента в процессе обработки тканей. При исследовании первичной структуры химозина было установлено, что химозины А и В отличаются только одним аминокислотным остатком в химозине А в положении 3 находится остаток аслара1Иновон кислоты, в химозине В остаток глицина. Были выделены нрохимознны Л и В. Все это свидетельствует о том, чго химозины Л. В и С соответствуют различным аллелям одного ii локуса 9. Химозин А может подвергаться ограниченному протсолизу с образованием компонента, имеющего только активности химозина А. Этот компонент элюируется в С фракции н представляет собой химозин . Из химозина В химозин С не образуется 8. Множественные формы прохимозина и химозина наблюдали Дсаго и Рэнд . При электрофорезе зимогена и фермента в полиакриламидном геле они обнаружили три полосы прохимозина и четыре химозина, две из которых значительно преобладали как для прохимозина. При фракционировании прохимозина на ДЭА Оцеллюлозе эти же авторы получили четыре фракции. Кристаллический химозин давал в этих условиях также четыре компонента. III и IV илентичны прохимозинам В. А и С. Фолыманном. Множественные формы химозина наблюдали гакже Степанов и i. Применив к полученному препарату химозина автоматическое определение последовательности аминокислот по Эдману авторы обнаружили две формы химозина, отличающиеся длиной иолнпептндной цепи главный компонент имел на конце остаток глицина, минорный остаток валива, причем цепь минорного химозина на концевом участке была на два остатка короче цепи главного компонента. V. Наряду с этим авторы показали наличие двух генетических форм главного компонента одну с остатком лейцина, другую с остатком метионина в ом положении хнмозин и хнмознн. Таким образом, микрогстсрогснность химозина может быть обусловлена как наличием генетически различных молекулярных форм фермента, гак и неоднозначностью процесса активации знмогена. Аминокислотный состав химозина заметно отличается от аминокислотного состава пепсина табл. В пепсине и химозине содержится почти одинаковое количество остатков дикарбоновых аминокислот xx и соответственно. Разница в количестве нейтральных аминокислот небольшая. Ферменты отличаются нзоэлектрическнмн точками. Изоэлектричсская точка епсина р. Первичная структура химозина В и ею профермента была установлена Фолыманном и i путем анализа аминокислотной последовательности . По данным Фольтманна аминокислотная последовательность химозина теленка представляет собой одну полинептндную цепь, включающую 3 аминокислотных ктатка. Первичная структура профермента включает 5 аминокислотных остатков. А рис. В про части прохимозина и пепсиногсна остатков расположены в идентичных положениях. Таблица 1. Аминокислотный состав химозина теленка и пепсинов свиньи и быка. I I. В V V I
I IVV
I V Г V V
II. V I V
II С С Л I V I. В РсЬ Б О I I. I О О А I в Л Т О О У в Е Р О I О С О I. РРцЛ РТ0У0УРЬ5Р8АУ1Ь0. Реп 5 С I Б У 8 I Р О О I Р 1. Рисунок 1. Сравнение первичных структур пепсипогена А свиньи, прохимозина, пенициллопепсина. Нумерация аминокислотных остатков по последовательности пспсиногсна Л. Остатки пропептида обозначены буквой р. Нумерация начинается снова с Мкоица активною пепсина А. Сокращение и ссылки неистинен А свиньи Р РеЛ 4. В РсЬ . Реп .