Предшественники бактериальных секторных протеиназ : Получение и характеристика

• Автор: Серкина, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление

Список использованных сокращений Введение

1. Литерату рный обзор.

Структура и функции предшественников бактериальных протеиназ

1.1. Предшественники субтилизиноподобных сериновых протеиназ бацилл субтилизин Е В. iii, субтилизин В. iiii, субтилизин
В. iii
1.1.1. Структура генов предшественников бациллярных просубтилизинов. Сравнительная характеристика

1.1.2. Получение предшественников и пропептидов субтилизинов

1.1.3. Процессинг предшественников субтилизинов и возможные механизмы активации

1.1.4. Взаимодействия пропептидов со зрелыми ферментами

1.1.5. Пропептид, как внутримолекулярный шаперон для белкового фолдинга. Функциональный анализ
1.1.6. Некоторые аспекты фолдинга субтилизина
1.2. Предшественники сериновых протеиназ химотрипсинового семейства алитическая протеиназа и химотрипсиноподобные протеиназы А, В, С, . Е i i , , ,,
1.2.1. Структурная организация генов, кодирующих предшественники химотринсиноподобных протеиназ
1.2.2. Изучение процессинга проферментов i viv
1.2.3. Изучение функциональной роли пропептида алитической протеиназы
1.2.4. Взаимодействия между пропептидами и зрелыми ферментами химотрипсиноподобных протеиназ . i
1.2.5. Сравнительная характеристика предшественников химотрипсиноподобных протеиназ бактериального и животного происхождения
1.3. Предшественники термолизиноподобных металлопротеиназ микроорганизмов
1.3.1. Структура генов, кодирующих металлонротеиназы, и краткая характеристика ферментов
1.3.2. Изучение активации предшественников металлопротеиназ i viv и i vi
1 Изучение функциональной роли пропептида термолизина
1.3.4. Изучение функциональной роли пропептида эласгазы . i
1.3.5. Изучение роли пропептида в секреции
2. Обсуждение результатов
2.1. Получение предшественника металлопротсиназы vii vi и изучение структурнофункциональных отношений в его молекуле
2.1.1. Экспрессия полноразмерного гена метаплопротеиназы В. vi прг в . i и анализ полученных продуктов
2.1.2. Идентификация компонентов
2.1.3. Очистка и разделение полученных компонентов
2.1.4. Определение молекулярной массы профермента
2.1.5. Пропсптид сильный ингибитор собственного зрелого фермента
2.1.6. Специфичность ингибирования
2.2. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. iii и изучение его процессинга i vi
2.2.1. Стратегия создания рекомбинантной экспрессионной системы
2.2.2. Конструирование модифицированного гена и анализ продуктов его экспрессии
2.2.3. Активация i vi профермента
2.2.4. Очистка активированного
2.2.5. Экспрессия в отсутствии пропептида.
2.3. Изучение функций пропептида карбоксипептидазы Т i vi методом делеционного анализа
2.3.1. Общая характеристика карбоксипептидазы Т Т. vi
2.3.2. Конструирование и экспрессия модифицированного гена
2.3.3. Очистка и характеристика растворимого продукта экспрессии модифицированного г ена
3. Материалы и методы исследования
3.1. Материалы
3.1.1. Ферментные препараты
3.1.2. Стандартные растворы
3.1.3. Среды для выращивания бактерий
3.1.4. Антитела
3.2. электрофорез в ПААГ
3.3. Иммуноферментный анализ методом Вестерн блоттинга
3.4. Анализ аминокислотных последовательностей
3.5. Определение протеолитической активности ферментов
3.5.1. Определение активности металлопротеиназы
3.5.2. Определение активности глутамилэндопептидазы
3.5.3. Определение активности карбоксипептидазы Т
3.6. Штаммы бактерий и плазмиды
3.6.1. Металлопротеиназа В. vi
3.6.2. Глутамилэндопептидаза В. iii
3.6.3. Карбоксипептидаза Т . vi СрТ
3.7. Условия культивирования
3.7.1. Рекомбинантный продуцент на основе Е. i
3.7.2. Рекомбинантные продуценты на основе форм 2 . iii
3.7.2.1. Трансформация форм
3.7.2.2. Адаптация культур форм к росту в жидкой 2 среде
3.7.2.3. Ферментация рекомбинантных штаммов 3 форм продуцентов СрТ и
3.7.2.4. Анализ экспрессии рекомбинантных генов 3 и в клетках форм . iii
3.8. Очистка и разделение компонентов В. vi
3.9. Определение молекулярной массы профермента
3 Определение кинетических параметров ингибирования зрелого 5 собственным пропептидом
3 Активация предшественника экзогенными протеиназами
3 Выделение зрелого фермента
3 Синтез иммуносорбента для карбоксипептидазы Т
3 Выделение карбоксипептидазы Т из культуральной жидкости
форм . iii
3роцессинг i vi секреторной формы СрТ
4. Выводы
5. Список литерату ры
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
дмсо диметилсульфоксид
ДМФА диметилформамид
кДа килодальтон
ПААГ полиакриламидный гель
РСА рентгеноструктурный анализ
ТХУ трихлоруксусная кислота
ЭДТА эти лен диам и нтетраацетат
альфалитическая протеиназа .
арг ген щелочной протеин азы субтилизина
вш сердечномозговой экстракт готовая сухая среда производства i
Спр термолизинподобная нейтральная протеиназа В.
СрТ карбоксипептидаза Т Т. vi
СрА карбоксипептидаза А
СрВ карбоксипептидаза В
динитрофенол
мясной бульон
глутамилэндопептидаза
глутамилэндопептидаза В. iii
I глутамилэндопептидаза В. ii
I изопропил1 тиорОгалактопиранозид
к, константа ингибирования
каталитическая константа
константа Михаэлиса
среда ЛурияБертани
нейтральная протеиназа металлопротеиназа
фенилметилсульфонилфторид
V поливинилидолдифторид
додсцилсульфат натрия
протеиназа . i
протеиназа В . i
протеиназа С . i
протеиназа . i
протеиназа Е глутамилэндопептидаза . i
I стрептомицетный субтилизиновый ингибитор
термолизин
i трисоксиметиламинометан
карбобензоксиглутамилпнифоанилид
Введение


Изучение процессинга проферментов i viv
1. Взаимодействия между пропептидами и зрелыми ферментами химотрипсиноподобных протеиназ . Изучение функциональной роли пропептида эласгазы . Экспрессия полноразмерного гена метаплопротеиназы В. Получение предшественника глутамилэндопептидазы В. Экспрессия в отсутствии пропептида. Общая характеристика карбоксипептидазы Т Т. Металлопротеиназа В. Глутамилэндопептидаза В. Карбоксипептидаза Т . Рекомбинантный продуцент на основе Е. Рекомбинантные продуценты на основе форм 2 . Анализ экспрессии рекомбинантных генов 3 и в клетках форм . Очистка и разделение компонентов В. Спр термолизинподобная нейтральная протеиназа В. СрТ карбоксипептидаза Т Т. I глутамилэндопептидаза В. В . С . Е глутамилэндопептидаза . Большинство охарактеризованных к настоящему времени протеиназ из различных источников первоначально синтезируются в виде лишенных активности предшественников проферментов, в молекулах которых после секреторного лидера препептида содержится активационный пептид пропептид. Известно, что активация предшественников, приводящая к появлению протеолитической активности, сопровождается отщеплением и деградацией соответствующих пропептидов. В отличие от препептидов, обеспечивающих транспорт белка через плазматическую мембрану, функциональная роль пропепгидов до конца не установлена. Предполагается, что пропептиды могут быть необходимы не только для поддержания фермента в неактивном состоянии, но и для формирования функциональной третичной структуры белка, направляя свертывание белковой глобулы. Изучение предшественников, их функциональной роли и роли их пропептидов требует, в первую очередь, наличия надежных способов получения проферментов, что в случае предшественников бактериальных протеиназ представляет сложную методическую задачу, которая до сих пор не решена. Основная проблема состоит в том, что предшественники бактериальных секреторных протеиназ, в отличие от предшественников пищеварительных ферментов млекопитающих, по своей природе не рассчитаны на длительное существование и в процессе секреции легко процессируются с образованием зрелого активного фермента. Поэтому получить предшественник бактериальной протеиназы в природном штамме не представляется возможным. Использование дтя этих целей стандартных экспрессионных систем в . В связи со сложностью получения предшественники бактериальных секреторных протеиназ изучены плохо, а существующие данные получены либо опосредованными методами, либо имеют отношение к реассоциированным комплексам зрелый ферментпропептид. Целью работы являлась разработка методов получения предшественников бактериальных секреторных протеиназ и характеристика последних. Т i vi. Предшественники субтилизинонодобных сериновых нротеиназ бацилл субтилнзин Е i ii, субтилизин В. Структура генов предшественников бациллярных просубтилизинов. Субтилизины представители семейства субтилизиноподобных сериновых протеиназ. К настоящему времени известно более представителей данного семейства, обнаруженных у грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, дрожжей, а также у высших эукариот 1. К наиболее изученным протеиназам этого семейства относятся субтилизины, секрегируемыс мезофильными видами бацилл субтилизин Е В. В ii 4, 5, субтилизин В. Эти субтилизины, благодаря имеющимся данным об их трехмерной структуре и нуклеотидной последовательности генов, кодирующих эти ферменты, часто используются как модельные системы для белковой инженерии 8. При анализе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего субтилизин П В. В. ii. Наличие пропептида различной длины между последовательностями сигнального пептида и зрелого фермента было характерно и для субт илизинов из других источников. Из аминокислотной последовательности препросубтилизина Е следует, что последовательность его препептида обладает рядом свойств, характерных для сигнальных пептидов, а именно наличие нескольких положительно заряженных аминокислотных остатков сразу за концевым и следующую за ними длинную гидрофобную область.