Разработка микрометодов анализа модифицированных и некодируемых аминокислот

• Автор: Иванов, Александр Райдович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 ВВЕДЕНИЕ.

1.2 ПРИМЕРЫ ПРИРОДНЫХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ФУНКЦИЙ

1.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ФОСФОРНЛИРОВАНПЫХ АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКАХ И ПЕПТИДАХ

1.2.1. ЗНА ЧЕНИЯИ ВИДЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ.

2.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛГИДРОКСИАМИНОКИСЛОТ, ПРИСУТСТВУЮЩИХ В ГИДРОЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ.
1.2.3. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОРНЛИРОВАНПЫХ И НЕФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ОБРАЩЕННОФАЗОВОЙ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМА ТОРГРАФИЕЙ

1.2.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИФОСФОСЕРИЛСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ СЕЛЕКТИВНЫМ ОСАЖДЕНИЕМ.

1.2.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОЧЕК ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В БЕЛКАХ.

1.2.6. АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХНФОСФОРИЛИРОВАНПЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ.

1.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОМОИИСТЕИНА
1.3.1. ГОМОЦИСТЕИН, ПРИРОДА, ПУТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНТЕЗА И КА ТАБОЛИЗМА, НА ТОФИЗИОЛОГИЧЕСКПЕ ЭФФЕКТЫ.
1.3.2. ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.
1.3.3. МЕТОДЫ, НЕ ТРЕБУЮЩИЕДЕРИВАТИЗАЦИИ СВОБОДНЫХ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА.
1.3.4. МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА.
1.3.4.1. ДЕРН В А ТИЗАЦИЯ ПРИ ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКОМДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.
1.3.4.2. МОДИФИКАЦИЯ ПРИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОМ ДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА.
1.3.5. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ АНАЛИЗЕ АМИНОТИОЛОВ
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1.РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
2.2. ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.
2.3.СИНТЕЗ ФТГ 1ЛМИНОЛИКЛОГЕКСАН1КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ФТГ АК1. РТН А А П. ФТГ 4АМИНОТЕТРАГИЛРОПИРАН4КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ФТГ АК2. РТН АА2Г ФТГ 1ЛМИНОЦИКЛОГЕКСАН1.4ДИКЛРБОНОВОЙ КИСЛО ТЫ ФТГ АКЗ.РТН ААЗУ.
2.4.ПРИГОТОВЛЕННЕ МОДИФИЦИРУЮЩИХ СМЕСЕЙ.
2.5.СИНТЕЗ РТН 8ЭТАНОЛНИСТЕИНА ИЗ ОФОСФОСЕРИНА
2.6.СИНТЕЗ ФТГ 3МЕТИЛБЭТАНОЛНИСТЕИНА ИЗ ОФОСФОТРКОНИНА.
2.7.СИНТЕЗ ФТГ еФЕНИЛТИОКАРБАМОИЛ8ГИДРОКСИЛИЗИНА ИЗ 8ГИДРОКСИЛИЗИНА
2.8.СИНТЕЗ ФТГ ОФОСФОТИРОЗИНА
2.9.МОДИФИКАНИЯ ПЕПТИДА. СОДЕРЖАЩЕГО ОФОСФОСЕРИН.
2. Ю.ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ
2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ГОМОЦИСТЕИНА. ПИСТЕИНА И ГЛУТАТИОНА В
ПЛАЗМЕ.
2ПРИГОТОВЛЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНЫХ СТАНДАРТОВ
2 ХРОМАТОГРАФИЯ
. ОФВЭЖХРЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГАК, ФРГ АК2 И ФТГАКЗ
. ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГБЭТАНОЛЦИСТЕИНА, ФТГ ЗМЕТИЛБЭТАНОЛЦИСТЕИНА И ФТГ О
Ф0СФ0ТИРИНА.
.0ФВЭЖХРЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ФТГ с
ФЕНИЛ ТИОКА РВА МОИЛ5ГИДРОКСИЛИЗИНА.
. ОФВЭЖХ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ И НЕКОДИРУЕМЫЕАМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ
.1. ОФВЭЖХ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО И НЕФОСФОРИЛИРОВАННОГО ПЕПТИДОВ
.2. ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ БЭТАНОЛЦИСТЕИНИЛПЕПТИД ПОСЛЕ МОДИФИКАЦИИ ОСТА ТКА ОФОСФОСЕРИНА.
.3. ВЫДЕЛЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ МЕТОДОМ ОФВЭЖХ.
. ОФВЭЖХАМИНОТИОЛОВ.
.1. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ И АЛКПЛИРОВАНИЯ ТИОЛОВ
.2. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПРОБОНОДГОТОВКИ.
.3. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ
.4. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ ФТГ АК, ОТЩЕПЛННЫХ ПРИ СЕКВЕНИРОВАНИИ ПЕПТИДОВ ИЛИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ В КА ЧЕСТВЕ СТАНДАРТОВ
2 МАСССПЕКТРОМЕТРИЯ
2 ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ВЭКЭ.
. ВЭКЭ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ФТГ АК.
. ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ
. ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ
2СЕКВЕНИРОВАННЕ ПЕПТИДОВ
2 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. АНАЛИЗ НЕКОЛИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДАХ.
3.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ.
3.3. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ. ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ
3.3. АНАЛИЗ ГОМОПИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ.
3.4. АНАЛИЗ ГОМОПИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭКЭ
4.ВЫВОД Ы
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
АК аминокислота, аминокислотный АТ аминотиол, аминотиольный АТЗ 2анлино5тиазолинон
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография, высокоэффективный жидкостнохроматографический
ВЭКЭ высокоэффективный капиллярный электрофорез, высокоэффективный
капиллярноэлсктрофорстический
ЭОП элекфоосмотический поток
МЭКХ мицеллярная электрофоретическая капиллярная хроматография массслсктромефия, массснектромефический
ОФВЭЖХ обращннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография,
обращеннофазовый высокоэффективный жидкостнохроматографический
ТГФ тетрагидрофуран
ТФУК трифторуксусная кислота
ТХУ трихлоруксусная кислота
ФИТЦ фенилизотиоцианат
ФТГ Зфенил2тиогидантоин
ФТК фенилтиокарбамоил
А А аминокислота, аминокислотный
АА1 1аминоциклогексан1карбоновая кислота
АА2 4аминотетрагидропиран4карбоновая кислота
ААЗ 1аминоциклогексан1,4дикарбоновая кислота
единицы абсорбции
относительные единицы абсорбции
диметилсульфоксид
динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
II глутатион восстановленный
глутатион окисленный
Псу гомоцистеин
монобиман
МВгВ монобромобиман
РТН Зфенил2тиогидантоин
относительные единицы флуоресценции
общее содержание гомоцистеина
0 время достижения детектора маркером электроосмотичсского потока ЭОП,
время достижения детектора мицеллами
ВВЕДЕНИЕ


Модифицированные аминокислоты являются продуктами либо посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков в составе пептидов и белков, кодируемых геномом организма, либо метаболических ферментативных превращений, в том числе, и свободных природных обычных аминокислот. Различают следующие основные виды поспрансляционных ковалентных модификаций пептидов и белков модификации, получающиеся в результате реакций, затрагивающих полипептидный скелет неферментативиые модификации модификации на уровне амииоацилтРПК ковалентные модификации аамино и карбоксильных групп аминокислотных остатков пептидов и белков модификации, затрагивающие боковые цепи аминокислот алкилирование, арилирование, дезалкилироваиис, дезарилирование гликозилированис, АДФрибозилирование ацилирование, дезацилирование, окисление, восстановление, гидроксилироваиие, галогенирование смешанные модификации одновременные модификации разной природы. По хронологии биосинтеза белка посттраисляционные модификации корректнее определять как претрансляционные, котрансляциониые и постгрансляционные но наиболее распространено их объединенное обозначение как поспрансляционных I. Нижеприведенные примеры показывают разнообразие биологических функций некоторых распространнных модифицированных аминокислот различной природы. Гпдроксинролин, гидроксилизнн и их глнкознды определяют свойства соединительных коллагеновых тканей и клеточных мембран. Количественный анализ этих модифицированных аминокислот является одним из элементов диагностики заболеваний, связанных с метаболизмом коллагенов . Аналог пролина, 2,3ЦС3,4транс3,4дигдроксЬпрол1ш был обнаружен в клеточных стенках диатомовых кремневых водорослей и в белковом материале клеточной стенки Мтсиа реШсиЬэа. Стенка зрелой клетки диатомовой водоросли состоит из плотной кремнистой оболочки, окруженной органическим покрытием сложной химической структуры и соединенной с ним. Помимо известных генетически кодируемых или модифицированных аминокислот и сахаров, клеточная стенка содержит множество до сих пор неидентифицированиых соединений, дающих нингидриновое окрашивание, а также ряда сахаров, уроновых кислот, и полисахаридов различной степени сульфирования. Одним из соединений клеточной стенки, дающих нингидриновое окрашивание, является 2,3цис3,4транс3,4днгидроксиЬпролнн, который был выделен и охарактеризован Т. Ыакарта и др. В дальнейшем было показано наличие этого соединения в кислотных гидролизатах клеточных стенок различных видов диатомовых водорослей разной морфологической организации 4. Аминокислотный состав актиномицина как и многих других природных пептидных антибиотиков, изобилует модифицированными аминокислотами и включает помимо треонина, гндрокентреонин, Овалнн, 4оксо5метилпролии, Згндрокснбмстилнролпн, саркозин, 1Чметилаланнн и 1Чметилвалин. Комплекс аминомицинов 7. БерЮтусеБгасНае, состоит из нескольких компонентов обозначаемых которые заметно отличаются от актиномицинов другого происхождения. В случае акгиномицина , например, цис5метилпролин является единственным иминокислотным компонентом, в то время как 4оксо5мстилпролин встречается как в , так и в 5. Различные модификации пролина распросфанены в пептидных природных антибиотиках, так, цис и трансЗгидроксипролнпы встречаются в теломицнне Згидрокси, 4гидроксн, 4оксо, 4оксометилпролин встречаются в разных актиномицинах 5. С1а, уОи была обнаружена в витамин Кзависимых факторах коагуляции, в костях, в белках почек, в почечных камнях и в местах патологического эктопического кальцинирования, таких как атеросклеротические бляшки 6. С1асодсржащих белков. Повышенное содержание ва в моче обусловлено такими фармакологическими и патологическими причинами, как зоокумариновая терапия 7 и остеопороз 8. Поэтому измерение выделения в1а является чрезвычайно важным диагностическим параметром в случаях, когда нарушены синтез или деградация витаминКзависимых белков. С1а является моноаминотрикарбоновой кислотой, образующейся в результате посттрансляционной модификации глутаматных остатков. Витамин К необходимый кофактор посттрансляционного биосинтеза С1а, который участвует в специфическом ферментативном карбоксилировании остатков глутамина в белках.