Конструирование фотоаффинных реагентов для использования комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот : Производные d(NTP), несущие перфторазидоарильные группы

• Автор: Сафронов, Игорь Викторович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 110 с. : ил.

1.1. Основные нуклеотиды НК как фотоаффшшые реагенты

1.1.1. Фотохимические свойства гетероциклов, нуклеотидов и нуклеотидов НК

1.1.2. Урацил, тимин и их производные

1.1.3. Цитозин и его производные

1.1.4. Аденин и его производные

1.1.5. Фотоаффикнал модификация белков производными гетероциклических

оснований

1.2. 4Тиоуриднн и другие тионуклеозиды

1.2.1. Исследования фотохимических реакций тионуклсотцдов в растворах

1.2.2. Реакции таонуклеотидов в составе макромолекулярных комплексов

1.3. 5Галондпиримиднны

1.3.1. 5Бромурацил 5Вгига
1.3.2. 5Иодуридин игс1 и 5иодцитидин Су1
1.3.3. Параметры, определяющие эффективность получения фотосшивок в составе белковонуклеиновых комплексов с помощью галоидпиримцдинов
1.4. Ароматические азиды
1.4.1. Общие фотохимические свойства ароматических азидов
1.4.2. Реакции ароматических азидов в составе макромолекулярных комплексов
1.4.3. Ааидонуклеозиды
1.4.4. Ароматические азиды, присоединенные к основаниям НК через спейсеры
1.4.4.1. 4Азидобензоильная группа
1.4.4.2. 4Азидофенацильная группа
1.4.4.3. 5Азидо2нитробснзоилъная группа
1.4.4.4. Перфторнрованные арилазидные группы
1.4.4.5. Другие арилазидные группы
1.5. Фотоактивные группы предшественники карбенов
1.6. Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I Синтез фотоактивиых аналогов
1.1. Экзозамещенные фотоакшвные производные
1.2. Псрсамтшрование ТР этиле нднаиином, аминооксн6утилщдроксилами1Юм и дигидразндом аднпиновой кислоты
1.3. Прямое переаминированис атшооксибутилгидроксиламино
1.4. Введение аминоэтиламидной группы в уфосфат АТР
1.5. Введение фотоакшвных групп и сенсибилизатора в полученные производные

2. Фотохимические свойства полученных аналогов
2.1. Изучение продуктов фотоиндуцированных реакций экзоЫазидагстрафтор6ензоиламинозтнлци1Т1Д1Щ5тр1фосфата
2.2. Возможный механизм образования химически активных продуктов
3. Субстратные элонгирующие свойства экзо замещенных аналогов в реакции
удлинения праймера V при использовании синтетических олигонуклеотидов в качестве праймеров и матриц
.3.1. Субстратные свойства некоторых экзо замещенных аналогов в реакции удлинения праймеров при использовании других ДНКполимераз и синтетических праймерматричных систем
.4. Биологические приложения
ЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕИТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
выводы
писок литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В работе использованы сокращения, изложенные в приложении к правилам для авторов журнала Биоорганическая химия , Т. , 7, а так же
НК нуклеиновые кислоты
2дезоксирибо и рибо цитидин5трифосфат
3 ароматический азид
нерфторированный ароматический азид
ароматический нитрен iмультиплетности
4азидотетрафторбензоильная группа
4азидотетрафторбензоиламино группа
4азидобегооильная группа
4азидофенадильная группа
5азидо2нигробегооиламино группа
4азидотетрафторбензилиденовая группа
4азидотетрафторбензилиденаминоокси группа
4азидотетрафторбензилиденгидразннокарбонильная группа
4 замещенные по экзоциклической аминогруппе производные
уАТР замещешше по уфосфатной группе производные АТР
ф квантовый выход
X длина волны электромагнитно го излучения АК аминокислота или е остаток
и 7i i синглстиый и триплетный энергетические состояния i время iго состояния, события и т. д.
Клнов фрагмент ДНК полимеразы I . i
мощность элекгромашишого излучения
V1 обратная транскригггаза вируса СПИД
О агслород в синглетном состоянии
v квант электромагнитного излучения
онДНК однонигчатая ДНК
днДНК двухнитчлтая ДНК
галоидуридин
5 5бромурацил
5I 5иодурацилцитозин
аквотированный электрон
ИКК интеркомбинационная конверсия
5Ыигс1 5азидо2дезоксиуридин
РМЕ рмеркаптоэтанол
ОТТ дитиотреитол
ББВ бедок, связывающийся с оцДНК.
ИКРА репликаннонный фактор человека
ТЕ А трмэтиламин
ЕОА этиденднамин
МКХ шжроколоночная хроматорафия
в. у. время удерживания
Введение


Для проверки лого предположения в качестве аффинных остатков были выбраны производные 2аииноэтилНСТР, находящиеся преимуществсшю в снамино форме, а также производные 4К4ам1цюокснбтнлокснНСТР и т4пиразидобутилкарбамнлбСТР у которых таугомерное равновесие сдвттнуто к кетимино форме . В качестве аффинного остатка был выбран также уамид АТР. Производные уамидов АТР используются РНК полимеразами в качестве инициирующих субстратов и. РНК. Цель данною исследования состояла в разработке реагентов для сашспецифичной фотомодификацни комплексов матричнозависимого стпггеза НК на основе перфторированых лаяазидобензи лиденовых групп и производных 1ЫТР. Синтезировать и охарактеризовать производные сЫТР, несущие РАВ РАВг и ЫАВг труппы, з также фогосенснбилтатор шдразон 9зтгтрацсналъдетида. Сравнтггь основные фотохимтптескне свойства полученных производных йЫТР. Оцстаггь элонгнрующис субстратные свойства фотоакпгвиых производных с1СТР при нспользовантпт ферментов матричнозависимого синтеза ДНК. Сравтгить эффективность и селективность фотоаффинной модификации белков комплексов матричнозависимою синтеза НК при использовании РАВ1, РАВг тс ЫАВг производных бСТР. ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Фотоаффинные реагенты для сайтспецифичной модификации комплексов матричнозависимого синтеза НК. Исследование работы комплексов матричнозависимого синтеза НК является чрезвычайно сложной задачей, для решения которой применяются многочисленные фнчикохнмические И геннототжочерн методу Метод фото. НК различных етащях функционирования исследуемых комплексов. Этот метод применяется также для иденшфикацни аминокислотных остатков, формтфующнх активные центры каталпнческих субъедннтщ ферментов или их непосредственное окружение. Для исследования близких по природе и структуре комплексов применяются разные по свойствам фотоаффинтгые реагенты. При их выборе исследователи часто пользуются критериями, нс связанными с фотохимическими свойствами рсакцнонносгюсобных групп. В данном обзоре сделана попытка снсгематиз1фовдть и проанализировать литературные данные но аффинной модификации комплексов матричнозависимого синтеза ПК с точки зрения 1фироды используемых фотоактивных групп. Поэтому основное внимание сосредоточено на изложении известных данных о фотохимических свойствах этих групп, о химических свойсгвах генерируемых при фотолизе чаепщ и интермедиатов. Кроме того, отмечены фотоиндущфуемые реакции, протекающие в условиях фотоаффинной модификации белково1уклешовых полимеразных комплексов с водой, буферными компонентами, компонентами НК и др. Основные нуклеотиды НК как фотоаффинные реагенты. Фотохимические свойства гетероциклов, иуклсозидов и нуклеотидов ПК. ГЙ облучения уклеиновые основания могут генерировать несколько типов реакционноспособных частиц . При облучении УФ светом с X 0 нм и интенсивностью втм2 большинство фотохимических 1фОЦСССОВ Проходят через первые возбужденные СОСТОЯНИЯ СИНГЛСТНОС 6ь т с или триплстнос 7,, х К7 с рис. При облучении производных гетероциклических основании УФ
светом с X нм происходит возбуждение на близкие к потенциалу ионизации по энергии состояния 5П и 7п, что может приводить к потере электронов и образованию катио рад жало в. Рис. Диаграмма электронных уровней гетероциклических оснований НК . Этот же процесс происходит при иоглогцешш кваипа света нуклеиновыми основаниями из метастабнльных или Г состояний при облучении импульсными лазерами с интенсивностью и 9 втм2, соответственно. При облучении белковонуклеиновых комплексов светом с X нм основная часть фотоиндуцируемых реакции начинается с ионизации ароматических амтнокнсютных остатков или переноса электрона с фотовозбужденного ароматическою аминокислотного остатка на находящееся в непосредственном контакте, наирнмер в стэкшпе. Образующийся тегерощжлическин анионрадикал присоединяет превращаясь в ргакционноспособнын радикал. Подобный механизм реализуется, в частности, при образовании ковалентных аддуктов Туг и 2, . Реакции из высших возбуждешсых состояний оснований НК в водных растворах приводят к появлению раджальных частиц 7, , когорые вызывают мношчислснные модификации нуклеиновых кислот и белков, особенно если предварительно не удалггь растворенный кислород. По реакционной способности и Ту состояния основных нуклеотидов располагаются в ряд i i 1.