Взаимосвязь активных центров неорганической пирофосфатазы E. coli в реакциях с фосфатсодержащими соединениями

• Автор: Григорьева, Ольга Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. Введение.

П. Взаимосогласованное функционирование активных центров в

го.чоолигомерных ферментах обзор литературы

1. Трамскетолаза

2. Глицин мстклтрансфераза

3 ФруетозоГббисфосфатаза

4. лактатдегидрогеназа.

5. Глутаматдсгидрогснсза

6. Аспартатгранскарбомоилаза

7. Орнитинкарбамонлтрансфераза.

Ш. Взаимосвязь активных центров неорганической пирофосфатазы i
КРРаза в реакциях с фоефатсодержяшнмн соединениями
Обсуждение результатов.
1. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы i с неорганическим фосфатом
1.1 Необратимое ингибирование ЕРРазы неорганическим фосфатом
1.2 Образование неактивного комплекса ЕРРазы с неорганическим фосфатом .
1.3 Центры связывания фосфата в апоЕРРазе и их взаимосвязь
2. Исследование рНзавнсимостн взаимодействия ЕРРазы с метилфосфатом.
3. Исследование влияния ионов металлов на инактивацию ЕРРазы метилфосфатом.
4. Определение молекулярных масс модифицированных ЕРРаз методом
М I масс пектро метр ни
5. Локализация остатка фосфорнлированной ликарбоновон аминокислоты.
5 1 Взаимодействие неорганической пирофосфатазы . i
с гидроксиламином
5.2 Локализация оегатка дикарбоиовой аминокислоты.
образующей ацнлфосфатную связь.
6 Сравнительное изучение кинетических свойств гримерной и
гексамерной форм ЕРРазы.
6 1 Получение гримерной формы ЕРРазы.
6 2 Кинетика гидролиза субстрата, катализируемого три мерной
формой ЕРРазы
6.3 Доказательство согласованного функционирования активных
центров ЕРРазы в катализе
7 Заключение
IV Зксперимснтальнан часть
1. Исходные вещества.
2. Методы исследования
2.1 Определение концентрации белка.
2.2 Определение активности пирофосфатазы.
2.3 Хроматографические методы анализа
2.3.1 Гельхроматография.
2.3.2 Ионообменная хроматография.
2.3.3 Обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.
2.4 Массспсюрометрический анализ
2.5 Ступенчатая деградация по методу Эдмана
2.6 Количественное определение содержания фосфат
в модифицированном белке.
3. Взаимосвязь активных центров неорганической пирофосфатазы
. i в реакциях с фосфатсодержащими соединениями.
3.1 Инактнваиня ЕРРазы фосфатсодержащими ингибиторами
3.1.1 Инактивация 1 мМ неор1амическим фосфатом.,.
3.1.2 Инактивация 0.5 мкМ неорганическим фосфатом
3.1.3 Реактивация модифицированной пирофосфатазы
3 2 Взаимодействие модифицированной пирофосфатазы с
гидроксиламином
3.3 Последовательная модификация пирофосфатазы фосфатсодержашнмн ингибиторами и этиловым эфиром лейцина
3.4 Влияние различных факторов на инактивацию ЕРРазы метилфосфатом. . 0 3 .4 I Исследование зависимости скорости инактивации
ЕРРазы метилфосфатом от
3.4.2 Исследование зависимости скорости инактивации ЕРРазы метилфосфатом от концентрации ионов магния
в инкубационной смеси.
3 4.3 Инактивация неорганической пирофосфатазы из . i пол
действием метилфосфата в присутствии сульфата или фосфата
3 4.4 Реактивация инактивированной метилфосфатом пирофосфатазы. .
3.4.5 Взаимодействие инактивированной метилфосфатом
ЕРРазы с гидроксилами ном
3.4.6 Расчет констант скорости инактивации ЕРРазы метилфосфатом.
3.5 Инактивация пирофосфатазы под действием диацетила
в присутствии метилфосфата. фосфата или сульфата.
3.5.1 Расчет констант скорости инактивации ЕРРазы метилфосфатом и
диацетилом, а также констант связывания лигандов с ЕРРазой.
4. Инактивация ЕРРазы гндроксиламином.
4.1 Инактивация ЕРРазы гнпроксиламином в присутствии ионов магния
4.2 Реакция ЕРРазы с гидроксил амином в денатурирующих условиях.
4.3 Идентификация остатка аспарагиновой кислоты, образующей гидроксамат.
5. Локализация аспартилфосфата
6. Определение коэффициентов седиментации ИТ и мутантных форм
ЕРРазы и продуктов их диссоциации.
7. Получение VV и мутантных тримеров ЕРРазы
8. Получение гексамерных форм и мутантных вариантов ЕРРазы
из соответствующих тримеров
9. Конструирование химерных гексамерных белков из ИТ
и мутантных . . К4Отримерных форм ЕРРазы.
Кинетика гидролиза различными формами РРазы .
.1 Кинетика гидролиза гсксамсрной формой ЕРРазы
.2 Кинетика гидролиза тримерной формой ЕРРазы
3 Кинетика гидролиза химерными формами ЕРРазы
7. . I
V Выводы.
VI Синеок использованной литературы.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ
РРаза неорганическая пирофосфатаза ЕРРаза неорганическая пирофосфатаза ii i УРРаза неорганическая пирофосфатаза vii дикий тип фермента Р неорганический фосфат i i ii а ннческнй пирофосфат РСА ректгсноструктурный анализ ТК транскеголаза ЛДГ лактаз дегидрогеназа ГДГаза глутаматдегядрогеназа АТСаза аспартаттранскарбомошша ОТСаза орнитннкарбамонлгрансфсраза ТИФ тиаминпирофосфат аденозил метионин аденозилгомоиистеин ФБФаза фруктозе1,6бисфосфатаза ФБФ фруктозо1,исфосфат АМФ аденозим5монофосфат АДФ адснознн5дифосфат АТФ аденозин5трифосфат ГДФ гуанозин5дифосфат А ффнцилптт КФ карбамоилфпсфат фосфоноацетилЬорнитин
I ix i iii i I iii
ОФВЭЖХ обращенкофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
МЕС 2Мморфолиноэтаисульфокислота
Ы2оксттилпиперазинК2этансульфокислота
ВВЕДЕНИЕ


Расгворимые пирофосфатазы явлются металлозависимыми ферментами Максимальную каталитическую активность фермент проявляет в присутствии иона двухвалентного магния, далее активирующий зффскт металлов уменьшается в ряду 2 . Каждый активный центр содержит четыре центра связывания двухвалентных ионов металла 8, . Два из них заполняются до связывания субстрата и обладают различным сродством к металлу, и третьем центре металл связывается с субстратом, а четвертый металл обнаруживается на ферменте лишь в присутствии продуктов ферментативной реакции Первый ион магния связан в центре высокого сродства Км с тремя белковыми лигандами , и 2, во втором центре ню кого сродства Кмг металл координирован с одной белковой руппой . Константы связывания магния в
центрах высокого и низкого сродства составляют Кхц мкМ и Кхю 1, мМ Существует еще один центр связывания металла пятый, который располагается вис активного центра, в области меягтримерного контакта и координируется шестью молекулами воды, которые в свою очередь образуют водородные связи с остатками с 1. А Ранее считалось . Л и через связанный ион магния, являются необходимыми для поддержания гексамермой структуры. Однако оказалось, что это не так Замена на или исключает связывание иона магния и увеличивает стабильность гсксамсра v . Ионы металла играют в белке многофункциональную роль Они создают конформацию белка, необходимую для связывания субстрата, и определяют прочность его связывания, контакт фосфатных групп с металлом увеличивает электрофидьность фосфорного атома, что существенно для эффективного последующего гидролиза, а также стабилизируют переходное состояние Кроме того, металлы участвуют в генерации нуклеофила. Информация, полученная при анализе большого числа пространственных структур, позволила высказать предположения о механизме гидролиза субстрата , В основе их лежали попытки либо идентифицировать кислород в фосфате продукте реакции, который был привнесен присоединяющейся молекулой воды в процессе гидролиза, либо обнаружить молекулу воды, которая еще до ухода продуктов гидролиза из активного центра уже заняла свое место для следующего акта гидролиза. В любом случае гидролиз пирофосфата осущеавляется при атаке активированной молекулой воды, обладающей низким рК. Согласованность метаболических процессов в клетке предусматривает регуляцию ферментативной активности. Несмотря на интенсивные исследования, вопрос о путях регуляции пирофосфатазной активности до сих пор остается открьггым. В настоящее время известны некоторые природные агенты и их аналоги, которые могут изменят ь активность пнрофосфатазы. Уже на ранних этапах исследований насыщения ферментов ионами металлов выяснилось, что связывание сопровождается конформационными изменениями и появлением разносгных УФспектров и спектров флуоресценции, что и явилось методами определения сродства металлов к ферменту . Интересны наблюдения, демонстрирующие взаимосвязь центров связывания ионов металлов. При исследовании насыщения фермента ионами металлов было обнаружено, что связывание металлов индуцирует конформационные изменения, причем перестройки структуры не ограничиваются только активным центром, а распространяются за его пределы, что демонстрируется влиянием ионов магния на состояние межзгримерных коттактов После того как в году была решена пространственная структура комплекса ЕРРазы с ионами магния 9 были получены доказательства появления асимметрии субъединиц при заполнении центров связывания ионов металлов Важнейшей особенностью этого комплекса является существование в нем грех видов субъединиц, которые отличались друг от друга степенью заполнения ионами магния второго центра В субъединице А второй цеггр насыщен ионами металла полностью, в субъединице В только на . С не более чем на . Существование в комплексе фермента с ионами металла трех типов субъединиц приводит к изменению группы симметрии фермента с К до Р, с потерей осей второго и третьего порядков. Еще одно доказательство появления асимметрии субъединиц ЕРРазы при связывании лигандов было получено при изучении структуры комплекса фермента с сульфатионом, который является аналогом продукта ферментативной реакции фосфата .