Идентификация иммуноактивных участков белка Е вируса клещевого энцефалита штамма Софьин с помощью синтетических пептидов

• Автор: Волкова, Татьяна Даниловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Иммунобиология вирусов семейства ПачтМае

1. Изучение антигенной структуры флавивирусов

1.1 исследование с помощью моноклональных антител

1.2 гипотетические модели пространственной структуры гликопротеина Е.

1.3 рентгеноструктурный анализ белка Е

1.4 исследование с использованием синтетических пептидов

1.5 антителозависимое усиление инфекции.

1.6 исследование с помощью е5саремутантов

2. Рецепторы и рецегтторсвязывающие участки флавивирусов
2.1 рецегтторсвязывающие участки белка Е
2.2 рецепторы флавивирусов
3. Проникновение флавивирусов в клетку путем слияния с клеточной мембраной.
4. Роль неструктурных белков в формировании противовирусного иммунитета
ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Изучение антигенной структуры гликопротеина Е
1.1 Выбор пептидов для синтеза
1.2 Синтез пептидов.
1.3 Иммуногенные и антигенные свойства пептидов 1Х1И.
2. Выявление фрагментов в последовательности белка Е, обладающих Тхелперной активностью.
2.1 Выбор фрагментов
2.2 Синтез пептидов.
2.3 Иммуногенные и антигенные свойства пептидов ХГУХХ
3. Установление последовательности, являющейся участком слияния вируса клещевого энцефалита с клеточной мембраной
ГЛАВА III ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Сопоставляя результаты топологического картирования гликопротеина Е, полученные в данной работе, с результатами аналогичного исследования, описанного выше , авторы приходят к выводу, что, несмотря на зависимость результатов картирования от спектра МКА и, возможно, штаммовых вариаций антигена, по ряду функциональных признаков домен А дальневосточного подтипа вируса сходен с доменом А западноевропейского подтипа, описанным в работе . Белки Е штаммов Софьин и Найдорф отличаются друг от друга лишь гремя аминокислотными заменами, из которых существенными представляются замены в положениях на и 6 на , а несущественной замена в положении 8 V на I. Было показано, что МКА, взаимодействующие с гликопептидным фрагментом ,5 кДа, связываются с белком Е штамма Найдорф с эффективностью на 1,52 порядка ниже, чем с белком Е штамма Софьин . Эти данные позволили авторам предположить, что сайты связывания исследованных антигенов с этими МКА включают точки аминокислотных замен или расположены в непосредственной близости от них, а также определить границы данного фрагмента в пределах остатков 6. При обработке белка Е восточного штамма Софьин вируса клещевого энцефалита бромцианом был выделен наиболее крупный фрагмент, являющийся гликопептидом ,5 кДа, который взаимодействовал с пятью из двенадцати изученных МКА . Вероятно, этот фрагмент аналогичен фрагменту массой кДа, полученному при расщеплении бромцианом белка Е штамма Найдорф, также содержащему углеводную часть и к которому относят эпитопы домена С. Изучение с помощью МКА антигенной структуры гликопротеина Е, являющегося основным носителем антигенных и иммуногенных свойств вируса, проводилось практически для всех представителей флавивирусов вируса Западного Нила , Денге , японского энцефалита , энцефалита СентЛуиса и энцефалита Муррей Валлей . При этом были выявлены эпитопы различной вирусной специфичности и дана характеристика их функциональной значимости. Однако наиболее глубоко антигенная структура гликопротеина Е была изучена для вируса клещевого энцефалита. Недавнее исследование белка Е вируса Денге2 при помощи картирования моноклональными антителами подтвердило правильность выводов, сделанных для вируса клещевого энцефалита, и показало очень схожие результаты . Так, авторы идентифицировали эпитопов, которые отнесли к трем функциональным доменам, названным, следуя принятой ранее номенклатуре, А, В и С. Гять эпитопов, объединенных в домен А, были найдены в трех пространственно независимых регионах. Эпитопы домена А были чувствительны к восстановлению белка, а МКА, связывающиеся с этими эпитопами, были способны к нейтрализации вируса и торможению гемагглютннации. Эпитопы домена А присутствовали на поверхности целого гликопротеина Е, триптического фрагмента массой кДа, содержащего первые 0 аминокислотных остатков последовательности белка Е, и триптического фрагмента массой кДа, включающего приблизительно остатки 10 белка. Четыре эпитопа, отнесенных к домену В, были выявлены благодаря своей локализации на поверхности фрагмента массой 9 кДа, полученного в результате обработки белка трипсином или химотрипсином аминокислотные остатки 00. Этот фрагмент, повидимому, идентичен аналогичному фрагменту, полученному при протеолизе белка Е вируса клещевого энцефалита . Эпитопы домена В обладали частичной устойчивостью к восстановлению и связывались с МКА, активными в реакциях нейтрализации и торможения гемагглютннации, хотя и в меньшей степени, чем МКА, определяющие домен А. Домены А и В пространственно связаны. Установление границ домена С более проблематично, хотя покрайней мере четыре эпитопа имели биохимические характеристики, позволяющие отнести их к домену С. Сравнивая первичную структуру белков Е различных представителей семейства Еачугсае можно видеть, что положение остатков цистеина в этих молекулах очень консервативно. С помощью ферментативного гидролиза и при использовании меченного Бцистеина было установлено положение ББмостиков в молекуле гликопротенна Е вируса Западного Нила . Было показано, что все шесть ББмостиков связывают остатки цистеина внутри молекулы белка следующим образом Суз 1Сув 2, Суэ ЗСуз 8, Суз 4СуБ 6, СуэбСуБ 7, Сув 9Суз , Сув Суэ, оказывая, повидимому, большое влияние на формирование ее нативной структуры.