Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus

• Автор: Гладких, Ирина Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 109 с. : ил.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.х.н. Козловской Э.П. За помощь в проведении отдельных разделов работы и ценные советы автор благодарит всех сотрудников лаборатории химии пептидов и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, принимавших участие в работе: д.х.н. Монастырную М.М., к.х.н. Ильину А.П., к.х.н. Лейченко Е.В., к.ф-м.н. Зелепуга Е.А., к.х.н. Вакорину Т.И., к.ф-м.н. Лихацкую Г.Н., м.н.с. Анастюка С.Д., м.н.с. Черникова О.В., вед. инженера-электроника Кулеш Ю.Г., а также сотрудников Института биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, г. Москва к.х.н. Гнеденко О.В., к.х.н. Мольнара A.A.и д.б.н. Иванова A.C.

Список используемых сокращений
а.о. - аминокислотный остаток
А.Ц. - активный центр протеиназы
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография Им - количество иммобилизованного полипептида Тр - трипсин ХТр - химотрипсин
AMCI - ингибитор 1 химотрипсина/катепсина G из пчелы Apis mellifera АТТ(р) - предшественник ингибитора трипсина из Arabidopsis thaliana BBBI - ингибитор Боуман-Бирк из ячменя
BBI - ингибитор Бауман-Бирка BIR - бакуловирусные ТАР повторения
BPTI (БПТИ) - бычий панкреатический ингибитор трипсина
CHFI - ингибитор фактора Хагемана из кукурузы
cIAPl - клеточный IAP белок
CI-2 - ингибитор химотрипсина из ячменя
CMTII - ингибитор трипсина из семян Cucurbita maxima
CrmA - цитокин, ответственный за определение А
ЕС - классификация ферментов
EDC - 1-этил-3-(3-димстил-аминопропил)карбодиимид GRAMM - Global Range Molecular Matching IAP - ингибитор апоптоза
IA3 - ингибитор аспарагиновой протеазы из Saccharomyces cerevisiae IUBMB - International Union of Biochemistry and Molecular Biology К; - константа ингибирования KD - константа диссоциации
LUTI - ингибитор трипсина из Linum usitatissimum
MALDI TOF MS - matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometer
MASP-I и MASP-II - MBL-связанная сериновая протеиназа MBL - маннан-связанный лектин МОЕ - Molecular Operating Environment

Na-Pi - ингибитор протеиназ из Nicotiana alata NHS - N-гидроксисукцшшмид
OMJPQ3 - третий домен овомукоида выделенный из яиц японского перепела OMSVP - овомукоид из фазана
OMTKY3 - третий домен овомукоида выделенный из индейки
PCI - ингибитор карбоксипептидазы из картофеля
PDB - Protein Data Bank
PI-3 - ингибитор 3 пепсина из Ascaris suum
PI-11 - ингибитор II из картофеля
РМР-С - ингибитор из саранчи Locusta migratoria ТАР - антикоагулянтный пептид
SMPI - белковый ингибитор металлопротеаз из Streptomyces
SSI - ингибитор субтилизина из Streptomyces albogriseolus
STFI-1 - циклический ингибитор трипсина 1 из подсолнечника
STI - ингибитор трипсина из семян бобов
Tdcn - температура денатурации
TIMP - тканевый ингибитор металлопротеиназ
WAP - кислый белок из сывортки
XIAP - Х-связанный IAP

Замена аминокислотного остатка Arg в участке Р'8 на остаток Lys в эглин С приводит к дестабилизации связывающей петли [107]. Для представителей многих семейств ингибиторов между участками Р2 и Р'( имеется большое количество водородных связей. Установлено, что в третьем домене несвязанного овомукоида водородная связь между аминокислотными остатками Thrl7 (Р2) и Glul9 (Р'О имеет большую длину, чем в комплексе (укорачивается до. 0,5 Â) (рис. 9). Это указывает на то, что образование комплекса энергетически выгодно [109]. Конформационный переход в участке связывающей петли ингибитора ATI из семейства Аскарис наблюдался при изменении pH среды. В то время как при значении pH 2,4 петля являлась достаточно жесткой, при значении pH 4,75 она становилась неустойчивой [110].
Вероятно, эти конформационные изменения являются результатом депротонирования аминокислотного остатка Glu32 и разрыва водородной связи между остатками Thr30 (Р2) и Glu32 (P'j). В то же время у другого ингибитора, ACMI (у которого Glu замещен на Gin) pH-зависимый конформационный переход не наблюдается [110]. Таким образом, структура ингибитора играет важную роль в формировании петли и сохранении ес конформации.
2.2.2.6. Семейство Куиитца
Наиболее интересным и интенсивно изучаемым семейством канонических ингибиторов протеиназ является семейство Кунитца. Самый исследованный представитель данного семейства - бычий панкреатический ингибитор трипсина (БПТИ) или апротинин, который ингибирует ссриновые протеиназы: трипсин и калликреин. Он был выделен и охарактеризован Нортропом и Куиитцем в 1936 году [42]. БПТИ имеет молекулярную массу 6500 Да, его молекула состоит из 58 аминокислотных остатков и стабилизирована тремя дисульфидными связями, что обеспечивает образование компактной третичной струкгуры (рис. 10).