Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения и исследование их гибридизационных характеристик

• Автор: Боярская, Наталья Петровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

Введение.

Литературный обзор

1. Физикохимические свойства пептиднонуклеиновых кислот

1.1. Растворимость

1.2. Химическая стабильность

1.3. Гибридизационные свойства

1.3.1. Образование дуплексов.

1.3.2. Образование триплексов.

1.3.3. Образование квадруплексов

2. Биологические свойства пептиднонуклеиновых кислот.
2.1. Стабильность ПНК в биологических системах.
2.2. Взаимодействие ПНК с ферментами.
2.3. Проникающая способность ПНК.
2.4. Антигенантисенсактивность.
2.4.1. Ингибирование репликации.
2.4.2. Ингибирование транскрипции.
2.4.3. Активация транскрипции.
2.4.4. Ингибирование трансляции.
3. Применение классических ПНК
3.1. II как потенциальные терапевтические агенты.
3.1.1. ПНК как противоопухолевые агенты.
3.1.2. ПНК как противовирусные агенты.
3.1.3. ПНК как антибактериальные препараты
3.1.4. ПНК против паразитических организмов.
3.2. Применение ПИК в молекулярной биологии
3.2.1. Селективное расщепление последовательностей нуклеиновых кислот
3.2.2. Очистка и выделение нуклеиновых кислот.
3.2.3. Анализ и определение генетических мутаций
3.2.4. ПНК как альтернатива Саузернблоттингу.
3.2.5. Контроль над ПЦР амплификацией.
3.3. Диагностика.
3.3.1. ПНКзонды
Создание библиотек.
ПНКМЯН технология
Киосенсоры и микрочипы
Технология РОпетли.
4. Доставка ПНК.
4.1. Использование неприродных катионных липосом.
4.2. Иепептидные векторы.
4.3. Конъюгаты ПНКпептид
Теоретическая часть
1. Синтез тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК различного строения
1.1. Синтез исевдонсптидных фрагментов мономеров отрицательно заряженных ПНК
. 1.1. Синтез сульфамидных производных псевдопептидных фрагментов
1.1.2. Синтез вторичных аминов с восстановленной пептидной связью
1.2. Синтез карбоксимстилированного производного тимина
1.3. Конденсация вторичного амина с тимин1ил уксусной кислотой.
1.4. Удаление аллилыюй защиты с акарбоксилыюй группы
2. Твердофазный синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных ПНК различного строения
3. Исследование г ибридизационных свойств отрицательно заряженных пептиднонуклеиновых кислот.
3.1. Определение стабильности комплексов, образованных между тиминсодержащими декамерами отрицательно заряженных ПНК и олигодезоксирибонуклсотидами.
3.2. Изучение биомолекулярного взаимодействия тиминсодержащих декамеров отрицательно заряженных пептиднонуклеиновых кислот с олигонуклеотидами с помощью поверхностного плазмонного резонанса 8РЯ.
Экспериментальная часть
Список используемой литературы


Химическая стабильность ПНКДНКкомплексов определяется стабильностью индивидуальных частей молекулы с одной стороны, ДНКчасть кислотолабильна, с другой стороны, она защищает ПНК от реакции отрыва концевого мономера Рис. Молекулы ПНК характеризуются низкой общей токсичностью 7 и в целом не склонны к неспецифическому связыванию с клеточными белками. С химической точки зрения пептиднонуклеиновые кислоты являются гибридом пептида и нуклеиновых кислот из структуры пептида заимствован принцип построения скелета молекул ИНК, а из структуры олигонуклеотида гетероциклические азотистые основания. Эта структурнофункциональная двойственность как раз и определяет их уникальные свойства способность к связыванию с комплементарными олигонуклеотидами, присущая структуре нуклеиновых кислот гибкость и прочность, характерная для белков. Декамеры ПНК, включающие в свой состав все четыре гетероциклических основания ,2, способны образовывать специфичные антипараллельные дуплексы ПНКПНК с Т. С Т. ДНКДНК . С и спиральной структурой,
подобной структуре ДНК и РНКдуилексов 8, а также менее стабильные параллельные дуплексы Т. С. Так как остов классических ПНК ахирален, то, по данным КДспектроскопии, возможно образование рацемической смеси право и левозакрученных спиралей ПНКПНКдуплексов. На направление закрученности спирали влияет а введение хиральной аминокислоты на Сконец цепи ПНК б природа боковой цепи этой аминокислоты аминокислоты с гидрофобной боковой цепью приводят к правозакрученной спирали, а с гидрофильной боковой цепью к левозакрученной спирали в длина дуплекса направление закрученности спирали, вызванное концевой аминокислотой, например лизином, распространяется на пар оснований ПНКПНКдуплекса г гетероциклическое основание, расположенное близко к хиральному центру гуанин или цитозин, изза большей стабильности в. С пар, обеспечивают более жесткую структуру 9. Для практических целей более важным является то, что ПНК способны также связываться с комплементарными ДНК и РНК в соответствии с правилами УотсонаКрика, образуя, в отличие от природных нуклеиновых кислот, как параллельные, так и антипарллельные дуплексы Таблица 1. Таблица 1. Т.пл. ДНКдуплекса 5 ТСТАССТСАСААСТА с комплементарной последовательностью . С. Т. РНКдуплскса 5 ТСТАССТСАСААСТА с комплементарной последовательностью . С. ВТ. ДНКдуплекса 51Аои комплементарной последовательности С. Буфер А мМ ЫаН2Р, 0 мМ С1, 0. М ЕЭТА 7. Б мМ фосфатный буфер, 0 мМ1МаС1 7. ПНК олигомер Нуклеиновая кислота Т. НТСТАССТСАСААСТАЫНз3 ДНК антипаралл. ТСТАССТСАСААСТА . РНК антипараллУпаралл. ТСТАССТСАСААСТА . Специфичность связывания ПНК с нуклеиновыми кислотами высокая Таблица 1. В зависимости от места замены одного основания на некомплементарное, а также от самого основания и последовательности ПНК, температура плавления их дуплексов с НК может изменятся от 8 до С. Было установлено , что стабильность комплекса, образованного между мером ПНК НТАТСАТТССТСННг и комплементарным участком последовательности ДНК, минимальна при наличии некомплементарного основания в 4ом положении от конца дуплекса Т. С. Некомплементарное основание в середине дуплекса не вносило значительных изменений в его стабильность. Также следует отметить, что максимальная дестабилизация характерна для АА и 00 пар. Анализ термодинамических параметров показал компенсацию энтальпияэнтропия в ПНКДНК ослабление связей при наличии некомплементарных оснований ДН0 компенсируется ослаблением жесткости структуры ДБ0 с образованием менее предпочтительных дуплексов с некомплементарной последовательностью. Отсутствие заряда в структуре ПНК обеспечивает стабильность их комплексов с природными нуклеиновыми кислотами вне зависимости от ионной силы раствора ионы Ыа выступают в качестве противоиона, уменьшая электростатическое отталкивание в случае образования природных ДНК и РНКдуплексов , Т. ПНКДНК уменьшалась на 5С при изменении концентрации С1 от мМ до 0 мМ Т. ДНКДНК изменялась на С Рис. Рис. Зависимость стабильности комплексов ПНКНК и НКНК от ионной силы раствора. Однако гибридизационные свойства зависят от более стабильное связывание наблюдается при 7. Таблица 2 .