Выделение и характеристика глутаматных рецепторов из мышцы саранчи

• Автор: Перестенко, Павел Валерьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с.

Оглавление:

Список условных сокращений -
Введение -
1. Глутаматные рецепторы (обзор литературы) -
1.1. Введение -
1.2. Классификация глутаматных рецепторов -
1.2.1. Глутаматные рецепторы КА/ГОА-типа -
1.2.2. Глутаматные рецепторы не-КГМБА типа -
1.3. Молекулярная биология рецепторов глутамата -
1.3.1. Молекулярная биология рецепторов
АМРА и каината -
1.3.2. Молекулярная биология метаботропных рецепторов глутамата -
1.3.3. Молекулярная биология глутаматных рецепторов ЫМОА-типа -
1.4. Глутаматные рецепторы беспозвоночных -
1.4.1. Глутамат-активируемые хлорные каналы беспозвоночных -
1.4.2. Ионотропные возбуждающие глутаматные рецепторы беспозвоночных -
1.5. Заключение -
2. Материалы и методы -
2.1. оборудование и материалы -
2.1.1. Оборудование -
2.1.2. Расходные материалы и реактивы -
2.2. Методы -
2.2.1. Выделение мембран из мышечной ткани
и нервной системы саранчи -
2.2.1.1. Определение концентрации белка -
2.2.2. Выделение рецепторных белков -
2.2.3. Реконструкция в липосомах -
2.2.4. Получение поликлональных
кроличьих антител Я
2.2.5. БЭБ-ПААТ электрофорез и электроперенос
на РУБГ мембраны -
2.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ -
2.2.7. Радиолигандный анализ -
2.2.8. Синтез 3-Н-(карбоксиацетил)-Ь-2,3-диаминопропионовой кислоты -
2.2.9. Электрофизиологическая характеристика рецепторного комплекса -
2.2.10. Триптический гидролиз отдельных белков выделенного рецепторного комплекса, очистка полученных пептидов и изучение

их аминокислотной последовательности -
2.2.11. Выделение мРНК из тканей саранчи -
3. Результаты и обсуждение -
3.1. Выделение глутаматрецепторного комплекса
из мышечных тканей саранчи -
3.1.1. Получение мембранных препаратов из
нервных и мышечных тканей саранчи -
3.1.2. Радиолигандный анализ связывания
Ь-[3Н]С1и и Ь-[3Н]Азр с препаратами мембран -
3.1.3. Солюбилизация -
3.1.4. Аффинная хроматография -
3.2. Радиолигандный анализ связывания Ь-[3Н]С1и и
Ь-[3Н]Азр с глутаматрецепторным комплексом
из мышечной ткани саранчи -
3.2.1. Реконструкция в липосомах -
3.2.2. Радиолигандный анализ связывания Ь-[3Н]С1и
и Ь-[3Н]Азр с протеолипосомами -
3.2.3. Характеристика участков связывания Ь-[3Н]С1и
с рецепторным комплексом -
3.2.4. Исследование влияния 3-1М-(со-карбоксиацил)-
Ь-2,3-диаминопропионовых кислот на
связывание Ь-[3Н]С1и с рецепторным
комплексом -
3.2.5. Вытеснение N - фтал а м о и л-Ь-глут ам ин о в о й
кислотой Ь-[3Н]С1и с реконструированного
рецепторного комплекса -
3.3. Исследование ионных каналов реконструированного
рецепторного комплекса -
3.4. Анализ выделенных рецепторных препаратов
с помошью БИБ-ПААГ и твердофазного ИФА -
3.5. Анализ первичной стуктуры белков рецепторного
комплекса -
3.6. Изучение экспрессии генов глутаматных рецепторов
в тканях саранчи в процессе онтогенеза -
Выводы -
Список литературы -

Список сокращений
ГР - глутаматные рецепторы
ДТТ - дитиотреит
Втах - максимальное число участков связывания лиганда
Kd - константа диссоциации
Ks - константа ингибирования
ЦНС - центральная нервная система
y-DGG - y-D-глутамилглицин
5-НРСА - 0,Г-3-гидрокси-4,5,6,7-тстраі идроксиоксазоло-[5,4-с]- пиридин-
5(7)-карбоновая кислота ACBD - 1-аминоциклобутан-1,3-дикарбоновая кислота
ACPD - цис-1-амино-1,3 дикарбоксициклопентан
АМРА - се-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолопропионовая кислота
ВВ-PDA - 1-(4-бромбензоил)пиперидин-2,3-дикарбоновая кислота
Br-HIBO - 4-бромгомоиботеновая кислота
CAPS . - З-циклогексиламино-1-пропансульфоновая кислота
СВ-PDA - 1-(4-хлорбензоил)пиперидин-2,3-дикарбоновая кислота
CGP40116 - [8-(КД)]-[3-[[1-(3,4-дихлорфенил)этил]амино]-2-гидроксипропил] (циклогексилметил)фосфоновая кислота CGS19755 - 7-трифлуорометил-4-(4-метил-1-пиперазинил)пирроло[1,2-а]-хиноксалин
CGS37849 - 4-[2-[[6-амино-9-(Ы-этил-Р-В-рибофурануронамидозил)-9Н-пурин-2-ил]амино]этил]бензенпропановая кислота CHAPS - 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1 -пропансульфоновая
кислота
CNQX - 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион
СРАА - транс-2-карбоксил-3-пирролидин-2,3-дион
CPG - 3,4-циклопропилглутаминовая кислота
СРР - 3-((+/-)-2-карбоксипиперазин-4-ил)-пропил-1 -фосфоновая
кислота
D-aAA - D-a-аминоадипиновая кислота

3). Один из этих районов и содержал Arg-481. Второй район находится в составе предполагаемого внеклеточного участка между DM3 и DM4.
1.3.2. Молекулярная биология ме 7 а б о тронных рецепторов глутамата
Первый ген, кодирующий субъединицу метаботропного ГР, был найден при изучении функциональной экспрессии в ооцитах Xenopus кДИК мозжечка крысы [Houamed, 1991; Masu, 1991]. Этот рецептор известен теперь как mGluRla. Для поиска аналогичных генов была использована последовательность, кодирующая mGluRl, и, с помощью разаработанных на её основе праймеров, позднее были идентифицированы ещё семь родственных генов и несколько вариантов сплайсинга для них [Abe, 1992; Minakami,1993; Nakajima, 1993; Okamoto, 1994; Pin, 1992; Saugstad, 1994; Tanabe, 1992; Duvoisin, 1995].
Все глутаматные метаботропные рецепторы оказались значительно большими по молекулярной массе (133кДа для mGluRl), чем ранее изученные рецепторы, связанные с G-белками, и не имели с ними какого-либо сходства в аминокислотных последовательностях. Основываясь на сходстве последовательностей, восемь известных типов mGluR были разделены на три группы (табл. 3), внутри которых идентичность последовательностей достигает 70% и падает до 45% между группами. Первая группа содержит mGluRl,5, вторая mGluR2,3 и третья mGluR4,6-8. Варианты сплайсинга были обнаружены у трёх рецепторов: mGluR 1(а-а, b-р, с,е), mGluR4(a,b), mGluR5(a,b) [Minakami, 1993; Pin, 1992; Simoncini, 1993; Tanabe, 1992].
Рецепторы первой группы, включая варианты их сплайсинга, при активации глутаматом стимулируют фосфолипазу С и далее гидролиз фосфоинозитидов и высвобождение Са2+ из внутриклеточного ретикулума. Какие именно из G-белков связываются с рецепторами первой группы до сих пор неясно, однако, в случае mGluR la, некоторые данные (частичное ингибирование активации фосфолипазы С коклюшным токсином в ооцитах Хепорш) свидетельствуют о том, что