Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Структурно-функциональное исследование Lon-протеиназы Escherichia coli

• Автор: Ротанова, Татьяна Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 280 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
РАЗДЕЛ 1. ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКТИВНОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ Обзор литературы
Введение

Глава 1. АААбелки

1.1. Строение и классификация АЛ4 белков

1.2. АЛАА азы и контроль качества внутримешочных белков

1.2.1. Шапероновые системы бактерий

1.2.2. Широкая специфичность и высокая селективность ААААТРаз

1.2.3. Адапторные белки

Глава 2. Протеолитнческне системы, осуществляющие селективную деградацию внутриклеточных белков

2.1. А зависимая деградация белков у эу бактерий 3

2.2. А зависимая деградация белков у эукариот
2.3. А ТРзависи.мая деградация беков в архебактериях
2.4. Общие характеристики функционирования энергозависимых протеин аз
и протеолитических комплексов
2.4.1. Общий моторный модуль ААА протеиназ
2.4.2. Связь между АТРазными и пептидазными составляющими
АААТ протеиназ
2.4.3. Общая стратегия узнавания мишеней А ТРзависимыми протеиназами
2.4.4. Катачиз процесса механического разворачивания белков ААА А ТРазами
2.4.5. Энергетическая цена селективного протеолиза
2.4.6. Энергозависимое разрушение стабильных белковых комплексов
Заключение
РАЗДЕЛ 2. СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕИНАЗЫ ii i Результаты работы и их обсуждение
Глава 1. Структурная характеристика нротеиназы . i
. , Доменное строение Еоппротеиназы
1.2. Протеолитические центры ферментов семейства нротеиназ
1.3. Подсемейства в семействе нротеиназ
1.4. Активные центры протеиназ и других пептидгидролаз с каталитической диадой
1.5. Заключение
Глава 2. Закономерности функционирования нативной протеиназы
. i
2.1. А ТРазная активность протеиназы i vi
2.1.1. АТРазная активность протеиназы и содержание ионов 2
2.1.2. Влияние аденозиндифосфата на А ТРазную активность протеиназы
2.1.3. Дополнительные центры связывания белкового субстрата в
структуре протеиназы
2.1.4. Функциональное значение эффекта активации гидролиза АТР протеиназой в присутствии белкового субстрата
2.1.5. Заключение
2.2. Активность протеолитических центров протеиназы i vi
2.2.1. Выбор субстратов для исследования функционирования протеолитических
центров протеиназы
2.2.2. Сравнительная характеристика гидролиза белковых и пептидных
субстратов протеиназой в стандартных условиях
2.2.3. Влияние нуклеотидов и ионов магния па функционирование пептидазных
центров протеиназы
2.2.4. Взаимовлияние субстратов протеолитических центров протеиназы
2.2.5. Заключение
Глава 3. Мутантные формы протеиназы и их характеристика
3.1. Мутантные формы протеиназы, несущие замены в АААмодуле
3.1.1. Получение мутантов протеиназы
3.1.2. Энзиматические свойства мутантных форм протеиназы i vi
3.1.3. Функциональная активность мутантных форм протеиназы i viv
3.1.4. Особенности функционирования мутантных форм протеиназы
3.2. Уникальные свойства мутанта КЗ
3.2.1. Влияние нуклеотидов и ионов магния на пептидазную активность мутанта КЗ
3.2.2. Комплементация мутаций 2 и 9А
3.2.3. Олигомерное состояние протеиназы и мутанта КЗ0
3.3. Заключение
щ, Глава 4. Укороченные формы протеиназы и их характеристика
4.1. Получение укороченных и модифицированных форм протеиназы
4.1.1. Рекомбинантные укороченные формы протеиназы
4.1.2. Укороченные формы протеиназы, полученные ограниченным протеолизом
4.2. Энзиматическая активность укороченных и модифицированных форм протеиназы
4.2.1. АТРазная и протеолитическая активность укороченных и модифицированных форм протеиназы
4.2.2. Пептидазная активность укороченных и модифицированных форм
протеиназы
4.3. Заключение
Глава 5. Кристаллическая структура индивидуальных доменов протеиназы
5.1. Описание структур протеолитического и аспирализованного доменов
5.2. Олигомерное строение протеолитического домена протеиназы
Ф 5.3. Протеолитический центр протеиназы
5.4. Сопоставление протеолитического домена протеиназы . i и ряда протеиназ, имеющих каталитическую диаду в активных центрах
5.5. Различия в связывании субстратов протеиназой и сериновыми протеиназами, имеющими в активном центре триаду i
5.6. Заключение
Перспективные направления в исследовании протеиназ семейства
Гоп заключение
РАЗДЕЛ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. МАТЕРИАЛЫ
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Штаммы . i
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Сопоставление аминокислотных последовательностей белков
3.2.2. Процедуры, использованные при работе с клетками
3.2.3. Сайтнаправленный мутагенез гена I
3.2.4. Выделение и очистка протеиназы, ее мутантных и укороченных форм
3.2.5. Ограниченный протеолиз протеиназы и ее мутантных форм.
Выделение фрагментов фермента
3.2.6. Исследование смешанных олигомеров протеиназы
3.2.7. Тестирование ферментативной активности
3.2.8. Исследование олигомерного состояния нативной протеиназы
3.2.9. Кристаллизация индивидуальных доменов протеиназы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


С другой стороны, функционирование зрелых клеточных белков зависит от их структурной целостности, однако, собственная нестабильность или внешние стрессовые воздействия могут приводить к нарушениям структуры гтшАэМ и к агрегации белков . Кроме того, повреждения структуры белков могут быть вызваны мутациями в кодирующих их генах, а также ошибками в транскрипции или трансляции. Таким образом, одной из жизненно важных задач клетки является необходимость восстановления репарации или деструкции поврежденных белков. К настоящему времени уже опубликован ряд обзоров, в которых обсуждаются вопросы контроля качества внутриклеточных белков 3, 6,,5, , , . Впервые термин контроль качества был применен для описания процесса конформационнозависимого молекулярного сортинга вновь синтезируемых белков эндоплазматического ретикулума 5. Системы контроля качества белков, присутствующие во всех без исключения клетках, включают молекулярные шапероны и энергозависимые протеиназы 5 6. Объектами выбраковки служат мутантные формы полипептидов, пептидные цепи, лишенные партнеров по гетероолигомерным комплексам, а также нативные регуляторные короткоживущие белки, содержание которых не соответствует метаболической потребности в них . И шапероны, и протеолитический аппарат прокариот и эукариот обнаруживают значительное сходство по функциональным характеристикам и физикохимическим свойствам. Общие принципы лежат также в основе механизма отбора субстратовмишеней и молекулярными шаперонами, и АТРазными компонентами протеиназ действительно, установлено, что последние могут проявлять шапероновую активность 7. Шапероновые системы бактерий В табл. Видно, что сеть шаперонов и протеолитических ферментов осуществляет не только контроль качества белков, но участвует также в регуляции и управлении специфическими путями белкового фолдинга. При этом согласно типу действия молекулярных шаперонов авторы работы э1 условно разделяют их натри различные группы холдеры, фолдеры и анфолдеры , , соответственно. Фолдеры . АААтипа шапероны, обеспечивающие разворачивание белковых молекул для последующей деградации с помощью ассоциированной пептидазы или рефолдинга с помощью кошаперонафолдера. НзсАНжбб . I vi i i i . I i ii, i . Среди анфолдеров наиболее широко представлены в . I. Эти белки подразделяются на два класса к классу I относятся шапероны и, кроме того, , которые состоят из вариабельной концевой части и двух АААмодулей типа 1 и 2, соответственно к классу II белки С1рХ и , содержащие только один АААгмодуль тина рис. У белков С1рХ и концевыми служат связывающие домены, а характерной чертой является отсутствие концевого домена, при этом имеет вставочный 1домен, локализованный между мотивами Уолкера рис. Наиболее выраженное различие между белками класса I заключается в линкерном фрагменте промежуточный или Мдомен, связывающем I и модул и рис. В состав этого фрагмента входит суперспирализованная последовательность, которая повторяется дважды в белках С1рС и и четырежды в С1рВ в С1рА такая структура не обнаружена. III
IV
I . Рис. Роль С1рВ, функционирующего в кооперации с ЕпаК1па1фолдерами, заключается в рефолдировании агрегированных белков я, , 1 рис. Другие АААшапероны С1рА, С1рХ, 1 ассоциированы с протеолитическими компонентами и образуют АТРзависимые протсиназы рис. У некоторых АААбслков шапероновый и протеолитический домены объединены в общей полипептидной цепи Ьоппротеиназа, рис. Подобно АААмодулям протеолитические субъединицы гстероолигомерных протеиназ образуют гекса или гептамерные кольцевые структуры, и в целом, протсиназы семейства С1рНзр0 представляют собой бочкообразные структуры с двумя кольцами протеолитических субъединиц, фланкированными с обоих концов кольцами АААмодулей см. Раздел 1, глава 2. Протеолитические активные центры секвестрированы внутри центральной полости, пронизывающей структуру протеиназы, и тем самым изолированы от окружающей среды. Доступ субстрата к протеолитическим центрам осуществляется через узкие поры фланкирующих колец, диаметр которых недостаточен для проникновения свернутых глобулярных белков.