Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillus subtilis: сравнительный анализ свойств и функций

• Автор: Буренина, Ольга Юрьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I. Механизмы регуляции транскрипции посредством некодирующих РНК в прокариотах и эукариотах (Обзор литературы)
L1. Природа и разнообразие некодирующих РНК
1.2. 6S РНК - бактериальная некодирующая РНК, регулирующая транскрипцию
1.2.1. История открытия и первых исследований 6S РНК
1.2.2. 6S РНК Escherichia coli
1.2.2.1. Функция 6S РНК
1.2.2.2. Генетическая организация гена ssrS, процессинг 6S РНК
1.2.2.3. Механизм функционирования 6S РНК как регулятора транскрипции
1.2.3. Характеристика 6S РНК из различных бактерий
1.2.3.1. Две 6S РНК Legionella pneumophila
1.2.3.2 Две 6S РНК Bacillus subtilis
1.3. Некодирующие РНК, регулирующие активность РНКП И в клетках эукариот
1.3.1 FC РНК - аптамер, связывающий РНКП II
1.3.2 Регуляторные РНК, кодируемые SlNE-элементами
1.3.2.1 AIu РНК человека и В1 РНК мыши
1.3.2.2 В2 РНК мыши
1.3.3. Некоторые некодирующие РНК, регулирующие транскрипцию при
взаимодействии с транскрипционными факторами
1.3.3.1. 7SK и TAR РНК
1.3.3.2. SRA РНК
1.3.3.3. U1 мяРНК
1.3.3.4. DHFR нкРНК
1.3.3.5. GAS5 РНК
ГЛАВА II. Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillus subtilis: сравнительный анализ свойств и функций (Обсуждение результатов)
II. 1. Выделение 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilis
И. 2. Выделение РНК-полимеразы Bacillus subtilis

1Г.З. Изучение комплексообразования 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП
11.4. Изучение конкуренции между 6S-1/6S-2 РНК и промоторами ДНК в условиях транскрипции in vitro
11.5. Особенности взаимодействия РНКП с 6S-1 и 6S-2 РНК: синтез пРНК
11.6. Исследование роли 6S-1 и 6S-2 PIIK В. subtilis in vivo
11.6.1. Характеристика клеточных линий В. subtilis, используемых для выяснения
роли 6S-1 и 6S-2 РНК in vivo
11.6.2. Синтезируются ли пРНК in vivo?
11.6.3. Влияние делеций генов bsrA и bsrB на экспрессию белков В. subtilis.
ГЛАВА III. Экспериментальная часть
III. 1. Реактивы и материалы
111.2. Приборы и методы
111.3. Общие методики
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.к. аминокислота
а.о. аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
БФС бром феноловый синий
кДа килодальтон
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ 1,4-дитиотреит (шрео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)
иптг изопропил-1 -тиофБЛ-галактопирапозид
Ки Кюри, единица измерения активности вещества
КЦ ксиленцианол
мРНК матричная РНК
миРНК малая интерферирующая РНК
мяРНК малая ядерная РНК
мяРНП малый ядерный рибонуклеопротеид
мякРНК малая ядрышковая РНК
НК нуклеиновая кислота
нкРНК некодирующая РНК
н.о. нуклеотидный остаток
н.п. нуклеотидная пара
ПААГ полиакриламидный гель
ПИК преинициаторный комплекс
иРНК pRNA, «product» RNA, продукты транскрипции с 6S РНК
РНК рибонуклеиновая кислота
РНКП РНК-полимераза
рРНК рибосомная РНК
РСА рентгеноструктурный анализ
Трис тркс-(гидроксиметил)ами нометан
тРНК транспортная РНК
УФ ультрафиолетовое излучение
Ф. к. финальная концентрация
ЭДТА этилендиаминтетраацетат, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

К.ЖХ'СО<Ж} СГ-ЗЯ! СХТ&-Л ггу КС
. л;>г-д са>; ал- г-. : .а ->аля V,-

В. яиШАбБ-! РНК
д1 г ли
?Г г* а с л с а л
лпоо ^ссс ^л^цалау <д;а са.*~~.г.к> -.к
,-АГСС С '^>5 ДААА”*;А. 'А-„ касала,^
и^ОСААЛУ ОСиАС «ДОС ССЯЛА. иаи ЦДЛ ~ЛАЗДДЛ! ААССУ
•рА % Аи
“С л АС- С К.

5. эиЬШЬ 65-2 РНК
АмоЧюои и<"^ио.-с' "л№же*"0<жх?*и
даелАА,даоо, .гсс.Сллл.аи схгад. ... мл... и
и и / ^
Ч.-*/
бв-2 РНК 58 РНК
Рис. 1.18. Предсказанная вторичная структура зрелой 68-1 РНК (190 н.о.) и 68-2 РНК (203 н.о.) В. яиЫШя [44] (А) и профили экпрессии 68-1 РНК (Б) и 68-2 РНК (В) В. яиЫШя, полученные при обсчете интенсивностей радиоактивных зон при Нозерн-блот-гибридизации с з:Р-меченными ДНК-зондами к 68-1, 68-2 или РНК [4]. Для нормирования использовалась интенсивность 58 РНК в точке, соотвествующей 3 ч культивирования клеток.
В работе [64] было проведено сравнение различных мутантых клеточных линий В. $иЫШ$ 168, содержащих как одиночные делеции генов ЬзгА (нокаут ЛЬкгЛ) или ЬкгВ (нокаут АЬягВ), так и делению обоих генов (двойной нокаут АЬ.чгЛВ). Отсутствие 68-1 или/и 68-2 РНК не приводили к каким-либо заметным изменениям в фенотипе мутантных клеточных линий при стандартном культивированиии клеток. Единственное отличие было обнаружено при наблюдении за ростом клеток после выхода из стационарной фазы после разбавления клеточной культуры свежей питательной средой (1:500 {У/У)). Клетки, лишенные 68-1 РНК, задерживались в лаг-фазе на 1-2 ч по сравнению с другими клеточными линиями, хотя в начале экпоненциальной фазы данная клеточная культура росла с той же скоростью и достигала тех же значений оптической плотности, что и другие линии (рис. 1.19А) [64]. Такой эффект не наблюдался в случае двойного нокаута, исходя из чего авторами был сделан вывод, что именно 68-2 РНК в отсутствие 68-1 РНК ответственна за «опоздание» клеточного роста.
На основе клеток с одиночным нокаутом АЬягА и двойным нокаутом ЛЬхгАВ были получены линии, несущие плазмиду, в которой были закодированы, соотвественно, природные гены Ь.чгА и ЬзгВ {АЪэгА -М и АЬвгА+В, АЬягЛВ+А и АЬягАВ+В) или гены, содержащие мутации 68-1 и 68-2 РНК (АЬягА +Ат и АЬхгА Вт, АЬ.чгАВ+Ат и