Получение и изучение свойств олигомерных форм неорганической пирофосфатазы Escherichia coli : Активация пирофосфатом

• Автор: Вайнонен, Юлия Павловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

1. Введение

2. Особенности функционирования неорганической 6 пирофосфатазы . i обзор литературы

2.1. Строение активного центра РРазы . i и механизм гидролиза 6 фосфоангидридной связи

2.2. Конформационные перестройки фермента

2.3. Межсубъединичные контакты фермента и олигомерные формы

3. Регуляция субстратом активности некоторых ферментов обзор литературы

3.1. Пируватдекарбоксилаза

3.2. Холинэстеразы

3.3. Фенилаланингидроксилаза 4

3.4. Рибонуклеотидредуктазы
4. Обсуждение результатов
4.1. Характеристика гексамерных форм , и РРаз
4.1.1. Седимсн тационный анализ
4.1.2. Сродство ионов магния в центре низкого сродства М2 в модифицированных вариантах РРазы
4.1.3. Определение независимых параметров гидролиза РРазой
4.2. Получение олигомерных форм нативной РРазы и ее мутантных вариантов
4.2.1. Получение тримерных форм нативной и мутантных РРаз, количественная характеристика процессов
4.2.2. Получение димерных форм нативной РРазы и ее мутантных форм, количественная характеристика процесса
4.2.3. Доказательство строения димера, мономерная форма РРазы
4.3. Изучение кинетических свойств олигомерных форм нативной и модифицированных РРаз
4.3.1. Кинетические свойства тримерной формы фермента, схема активации гидролиза субстрата КРР, пирофосфатом
4.3.2. Обнаружение влияния эффекторного центра на гидролиз субстрата гексамерными формами РРазы
4.3.3. Кинетические свойства димерных форм нативной и С1и5С1п РРаз
5. Экспериментальная часть
Приложение
Выводы
Литература


Настоящая работа посвящена исследованию межсубъединичных контактов фермента, роли четвертичной структуры. Для этого предстояло решить следующие задачи 1 изучить кинетические свойства гексамерных форм пирофосфатазы с заменами в области межтримерного контакта или вблизи нее и пирофосфатаз, а также модифицированного производным АТР по остатку 6 фермента 2 получить различные олигомерные формы нативной пирофосфатазы и ее мутантных форм, количественно охарактеризовать взаимные переходы 3 исследовать кинетические свойства полученных форм. Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава посвящена функционированию пирофосфатазы Е. Поскольку в ходе работы выявлен факт активации гидролиза субстрата свободным пирофосфатом, во второй главе обзора литературы рассмотрены некоторые примеры ферментов, для которых характерна регуляция субстратом или его струкгурным аналогом. ПИРОФОСФАТ АЗЫ . Строение активного центра РРазы . Гексамерная РРаза . РРаз, состоит из шести идентичных субъединиц, и может рассматриваться как димер тримеров. Два тримера расположены в параллельных плоскостях и повернуты друг относительно друга на . Каждая субъединица состоит из 5 аминокислотных остатков и имеет активный центр, который образован нерегулярными участками полипептидных цепей. В гидролизе принимают участие три четыре иона металла два иона с разным сродством присоединяются к ферменту в центрах и М2 до связывания пирофосфата магния, а два других обнаруживаются в присутствии субстрата. Ионы магния являются наиболее эффективными активаторами, эффективность других металлов активаторов уменьшается в ряду 2 2 Со2 2 а Са2 является сильным ингибитором РРаз . Роль металлов активаторов в гидролизе многообразна они обеспечивают активацию фермента, субстрата и молекулы воды, атакующей РР, определяют специфичность в отношении субстрата, а также выступают акцептором уходящей группы. Для РРазы . Согласно рентгеноструктурным данным, лигандами металла в центре высокого сродства являются остатки аспарагиновой кислоты , и 2. Единственный белковый лиганд 2 в центре низкого сродства М2 второй кислородный атом рис. Координационные сферы ионов металла дополнены молекулами воды до октаэдрической координации . Эти ионы магния служат для организации структуры активного центра, экранирования избыточног о отрицательного заряда и активации молекулы воды для нуклеофильной атаки. На основании структуры комплекса РРазы . М3, координированный и 2, субстратный металл. Роль этого иона металла заключается в активации молекулы субстрата. Л0 о
Рис. Схема строения активного центра РРазы . Рис. Схема межтримсрного контакта в РРазе . РРазы с ионами марганца и фосфатами, лигандом иона металла в центре М4 служит в РРазе . Заполнение центра М4 приводит к ингибированию гидролиза РРазой . В случае ионов марганца ингибирующий эффект ионов металла наступает при значительно меньших концентрациях ионов металла. Замена аминокислотных остатков, участвующих в связывании четвертого иона магния, приводит к исчезновению ингибирующего эффекта . Точная роль ингибиторного 2 остается невыясненной, но можно предположить, что он необходим для связывания при обратной реакции синтеза . Кроме четырех ионов металлов в активном центре, в РРазе . Каждый из них образован остатками , , двух субъединиц из разных тримеров. Ион магния взаимодействует с этими остатками через молекулы воды. Высказано предположение, что роль этого иона металла состоит в поддержании олигомерной структуры РРазы. Е еРР ЕРР, ЕР,, ЕР, Е Схема 1. М2 , . Атакующая молекула воды должна находится в положении ii по отношению к расщепляемой связи. Такое взаимное расположение молекулы воды и субстрата не реализуется в структуре РРазы . М2 способна находиться в нужном положении . Правильность сделанных выводов подтвердило рентгеноструктурное исследование ферменгсубстратного комплекса РРазы из дрожжей, ингибированного фторидионами . Ион фтора связывается с ферментсубстратным комплексом, следовательно, механизм ингибирования бесконкурентный. Предполагалось, что фторид ингибирует фермент за счет замещения нуклеофильной молекулы воды.