Пространственная структура комплекса рибосомного белка S15 с фрагментом 16S рибосомной РНК из Thermus thermophilus

• Автор: Никулин, Алексей Донатович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Современные представления о структуре рибосом.

1. Введение.

2. Структура рибосом и отдельных субчастац

2.1. Злехтронномнкроскопнчсскис исследования рибосом.

2.2. Исследования рибосом рентгеноструктурным методом

2.2.1. Структура рибосомной субчастицы Т. i с

разрешением 5.5А

2.2.2. Структура рибосомной субчастицы Т. i с

разрешением 4. 5.

2.2.3. Структура рибосомной субчастицы ii с разрешением 5.
2.2.4. Структура рибосомы Т. i с разрешением 7.
3. Структуры отдельных компонентов рибосом.
3.1. Структурные исследования рибосомной РНК.
3.2. Структурные исследования рибосомных белков
3.3 Взаимодействие рибосомных бслхов с рРНК
3.4. Пространственные структуры РНКбслковых комплексов
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и методы.
1. Материалы.
1.1. Химические реактивы и ферменты
1.2. Буферы
1.3. Среды.
2. Методы
2.1. Методы генной инженерии.
2.1.1. Выделение плазмидиой ДНК из небольших объмов культуры
2.1.2. Выделение и очистка плазмидиой ДНК из больших объмов культуры
2.1.3. Полимеразная цепная реакция
2.1.4. Электрофорез в агарозном геле
2.1.5. Очистка фрагментов ДНК.
2.1.6. Лигирование ДНК
2.1.7. Получение компетентных клеток i
2.1.8. Трансформация компетентных клеток плазмидиой ДНК.
2.1.9. Определение первичной структуры ДНК
2.1 Обработка информации о последовательностях нуклеотидов и белков
2.2. Препаративное выделение и очистка РНК.
2.2.1. Синтез РНКфрагмептов с помощью транскрипции i v.
2.2.2. Очистки РНКфрагмеитов с помошчо гедьфипътрацнн .
2.2.3. Очистка Р1 iфратментов ионообменной хроматографией.
2.2.4. Электрофоре в ПАЛГ8М мочевине при денатурирующих условиях
2.2.5. Электрофорез в ПААГ ь нативных условиях
2.2.6. Очистка РНКфрагментов электрофорезом на геле в
дснатурирующггх условиях
2.3. Экспериментальные процедуры при работе с белками
2.3.1. Электрофорез ы ПААГ
2.3.2. Суперпродукция рибосомного белка Т. i в клетках
. i.
2.3.3. Выделение рибосомного белка Т. i
2.3.4. Суперпродукиия и выделение рибосомного белка Т. i с заменой метионинов на селенометионниы
2.3.5. Спектроскопический анализ белков.
2.4. Получение и кристаллизация комплекса 7 i РНК.
2.4.1. Получение комплекса РНК Т. i.
2.4.2. Кристаллизация комплекса РНК Т. i
2.5. Методы рентгеновской кристаллографии
2.5.1. Условия замораживание кристаллов.
2.5.2. Условия получения тяжелоатомных производных кристаллов.
2.5.3. Сбор и обработка рентгеновских дифракционных данных
2.5.4. Определение структуры комплекса
2.5.5. Уточнение структуры
2.5.6. Анализ полученной структуры
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Получение и кристаллизация комплекса рРНК.
1.1. Получение и очистка РНКфрагментов
1.2. Получение и выделение белка Т i дикого типа и мутантных
1.3. Получение кристаллов комплексов с фрагментами
2. Определение пространственной структуры комплекса рибосомного белка
рРНК из Т. i
2.1. Нахождение условий замораживания
2.2. Определение стартового набора фат.
2.3. Расчет фаз, полученных методами изоморфного замещения и методом аномального рассеивания на многих длинах волн
2.4. Построение и уточнение пространственной модели комплекса
3. Анализ пространственной структуры комплекса рибосомного белка с фрагментом рРНК из Г. i.
3.1. Особенности структуры белка в комплексе.
3.2 Структура РНКфрагмента.
3.3. Взаимодействие белка с молекулами РНК.
3.3.1. Области связывания белка с I ЗК
3 3.2. Предполагаемая модель связывания белка с рРНК
.3. Предполагаемая модель взаимодействия белка с мРНК
.4. Предполагаемая модель взаимодействия белка с рРНК
ВЫВОДЫ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Как и некоторые другие рибосомиые белки, белок яв. РНК ii . Недавно было показано, что белок может специфически взаимодействовать с петлей рРНК. Таким образом, белок важен для функционирования и сборки рибосомы н является чрезвычайно интересным объектом для исследования механизмов взаимодействия белков с РНК, поскольку взаимодействует с трмя различными РНК. В результате данной работы были получены кристаллы комплекса белка . РНК и определена структура комплекса с разрешением 2. А. Летальный анализ структуры комплекса представлен в разделе Результаты и обсуждение. Литературный обзор посвящен современному представлению о структуре рибосомы и с отдельных компонентов рибосомных белков, рибосомной РНК, а также взаимодействиям между рибосомнымн белками и РНК. История открытия рибосом начинается в годах, когда А. Клод выделил из животных клеток цитоплазматические РНКсодсржащие гранулы меньшие, чем митохондрии. П1 гранулы были размером 0 мкм а диаметре, и позднее Клод назвал из микросомами. Химический анализ показал, что микросомы являются фссфолишдрнбонуклеопрогсндными комплексами, й 3 6 году Дж. Патад ivii. Микросомы Клода являлись фрагментами эндоплазматнческого ретикулума с прикрепленными частицами Палада. Последние оказались рибонуклсопротсиднымн частицами, содержащими большую часть РНК. В нескольких лабораториях в середине х годов удалось выделить эти частицы в свободном состоянии из различных организмов из дрожжей , из растений . Е i ii частицы. В году состоялся первый симпозиум в Массачусетском технологическом институте, посвященным этим частицам и их участию в биосинтезе белков. Там они получили название рибосомы, которое используется и сейчас. Так начиналась история исследования рибосом, которая длится уже более лет. Рибосомы состоят из двух рибосомных субчастиц большой и малой, каждая из которых содержит рибосомную РНК и рибосомные белки. Рибосомная РНК находится в связанном с ионами магния и кальция состоянии. В рибосомах присутствуют также органические катионы спермин, спсрмндин, кадаверин л путрссцин в количестве до 2. Большая включает в себя две рибосомные РНК 8 и 5Б рРНК и розных белков, малая одну Б рРНК и белок. Основные характеристики рибосом приводятся в таблице 1. Таблица 1. Молекулярная масса. Да 2. Размер. Первоначальные данные о морфологии рибосом были получены еще в е годы электронной микроскопией ЭМ с использованием методов негативного контрастирования или оттенсния металлом. Полученные модели Viiv и субъединиц . Viiv достаточно точно описывали их морфологию рис. Согласно этим моделям. А имеющие головку и асимметричное тело с боковой лопастью, разделенные бороздой. При формировании рибосомы головка малой еубьединкцы примыкает к центральному протуберанцу большой субъединицы, а лопасть обращена к выступу, образованному белком i , Viiv . Дальнейшее развитие техники электронной микроскопии позволило повысить разрешение и получить более объективную информацию о морфологии рибосом I 3, , . Рис. Модели рибосомы и отдельных субчастиц . Г головка. Т тело. ЦП центральный протуберанец, 7 палец, выступ белка 1. В середине х годов был достигнут значительный успех по определению аруктуры рибосомы и субъединиц методом электронной микроскопии с использованием трехмерной реконструкции изображений замороженных рибосом . Используя этот метод, две независимые исследовательские фуппы получили в году сходные результаты по структуре рибосом из ii i с разрешением около , . Модель рибосомы в обоих случаях имеет средний диаметр около 0 А и содержит примерно растворителя. Полученные данные показали, что рибосома еще более нерегулярна, чем представлялось ранее, и подтвердили выделенные ранее с помощью электронной микроскопии детали строения, включая головку, шейку, борозду и платформу малой субъединицы и три протуберанца в верхней части большой субъединицы. Размеры и форма субъединиц, так же как и геометрия целой рибосомы, совпадают с предшествующими результатами. При разрешении А оказалось возможным выделить много новых морфологических деталей.