Структура и функции новых белков респираторного эпителия rSec14p и rYm1olf

• Автор: Ильницкая, Елена Вячеславовна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с. : ил.

Введение

1.Хи гиназы и хитиназоподобные белки Литературный обзор

1.1. Хитин и хитозан

1.2. Хитинолитические ферменты

1.3. Семейство гликогидролаз

1.4. Представители семейства гликогидролаз млекопитающих

1.4.1. Истинные хитиназы млекопитающих

1.4.2. Хитиназоподобные белки млекопитающих

1.5. Специфичность хитиназоподобных белков

1.6. Уровень экспрессии генов хитиназ и хитиназоподобных белков в организмах млекопитающих в условиях синдрома иммунного воспаления

1.6.1. Инфецирование млекопитающих микроорганизмами

1.6.2. Аллергия и астма
1.6.3. Окислительное повреждение тканей
1.6.4. Неопластические образования
Заключение
2. Результаты и обсуждение
2.1. Изучение функциональных свойств гБес р
2.1.1. Оценка уровня синтеза гБесНр и обнаружение нового белка гУт1о1Г в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением
2.1.2. Определение уровня экспрессии гена гесМр в обонятельной выстилке крыс с
хроническим воспалением
2.2. Идентификация нового белка гУт1оиз обонятельной выстилки крысы
2.2.1. Определение Мконцевой аминокислотной последовательности
2.2.2. Массспектромстрический анализ белка гУш 1 о
2.2.3. Определение частичной аминокислотной последовательности гУт1о1Г
2.2.4. Сравнение полученных результатов с базой данных ОепВапк
2.3. Установление последовательности полноразмерной кДНК и полной первичной структуры белка гУт I о1Г из обонятельной выстилки крысы
2.3.1. Подбор экспериментальной модели животных с острым воспалением
2.3.2. Получение фрагмента кДНК, кодирующего белок гУт1оГ
2.3.3. Определение 5 и Знетранслируемых областей кДНК гУт1о1Г
2.3.4. Определение полноразмерной последовательности кДНК и аминокислотной последовательности белка гУт1о1Г
2.4. Структурные особенности белка гУпПо представителя семейства гликогидролаз
2.5. Исследование уровней экспрессии генов белков гУт1о1Р и гБссНр из обонятельной выстилки крыс на модели острого воспаления
2.6. Проверка экспрессии гена СЫ4 в обонятельной выстилке крысы
Заключение
3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
3.1.3. Буферы и растворы
3.2. Модели животных
3.3. Методы исследования
3.3.1. Выделение и очистка природного гБесМр из обонятельной выстилки крыс
3.3.2. Получение моноклональных антител к белку гБес р
3.3.3. Вестернблот анализ геср
3.3.4. Выделение суммарной РНК и синтез кДНК
3.3.5. Полимеразная цепная реакция
3.3.6. Количественная ПЦР в реальном времени
3.3.6.1. Определение уровня экспрессии гена гБеср в обонятельной выстилке крыс с хроническим воспалением
3.3.6.2. Исследование уровней экспрессии генов белков гУт1оГ и гБеср из обонятельной выстилки крыс на модели острого воспаления
3.3.7. Приготовление гистологических срезов
3.3.8. Компьютерная обработка данных
3.3.9. Определение частичной аминокислотной последовательности гУт1о1Г
3.3 Получение компетентных клеток и их трансформация
3.3 Работы с фрагментами ДНК, их клонирование и определение нуклеотидных последовательностей
4. Выводы
Благодарности
5. Список литературы
Список сокращений
i хитиназа
I хитиназный внутренний домен
хитиназоподобный белок
ЕСМ внеклеточный матрикс
рецептор эпидермального фактора роста
киназа фокальных адгезий
гликозилгидролазы
I интерлейкин
МСР1 моиоцитарный хемоатграктивный белок1 М1Р1а макрофагальный белок воспаления1 а РКВ фосфатидилкиназа В
3,4, фосфатадил инозит3,4,5трифосфат
трансформирующий фактор роста
I фиозофосфатизомер
Трегуляторные клетки
ААМф альтернативно активированные макрофаги
БЛД бронхолегочная дисплазия
ГМКСФ гранулоцитарномакрофагальный
ГСПГ гепарансульфатпротеогликаны ИНФ интерферон
ОНП однонуклеотидный полиморфизм ОРДС острый респираторный дистресссиндром ОФВ1 объемом форсированного выдоха за 1 с ПРР паттернраспознающие рецепторы СОПЛ синдром острого повреждения легких ФАТ фактор активации тромбоцитов ФИО фактор некроза опухоли ФРФ фактора роста фибробластов
колониестимулирующий
ВВЕДЕНИЕ


Неспецифическая иммунная защита слизистых оболочек, выстилающих эпителиальные ткани, является одной из систем, нарушение работы которой приводит ко многим социально значимым, в первую очередь бронхолегочным, заболеваниям, являющихся огромной проблемой всего мира, и с каждым годом актуальность их исследования лишь возрастает. При инфекционных процессах слизистая дыхательных путей становится местом развития иммунных процессов, которые сами по себе могут оказаться деструктивными. И самый масштабный и неадекватный характер иммунные процессы в слизистой приобретают при развитии гипсрергических воспалительных процессов при аллергии, астме. Несмотря на достигнутый за последние годы прогресс в этой области, в развитии понимания механизмов протекания, клинического разнообразия, условий, способствующих хроиизации воспаления, и, как следствие, фармакотерапии, непрекращающийся рост заболеваемости этими патологиями приводит к выводу, что их причины многофакторны, далеко не все участники развития процесса идентифицированы и изучены. Поэтому большой фундаментальный и практический интерес представляет задача определения специфических маркеров, белков, сопричастных появлению и протеканию воспалительных процессов в эпителиальных тканях воздухоносных путей. Наиболее острой проблемой в последние годы стал резкий рост случаев заболевания бронхиальной астмой, которая характеризуется пожизненным течением и высокой скоростью развития обострения. Как любой воспалительный процесс, эта патология сопровождается инфильтрацией иммунных клеток, однако, остается до конца неясным, что вызывает или способствует постоянному поддержанию концентрации этих клеток при хроническом течении заболевания, то есть, неизвестны факторы, инициирующие хронизацию воспаления. Открытием, с которым в последние годы связывается надежда на выявление новых маркеров и перспективных терапевтических мишеней развития острого и хронического воспалений, явилось обнаружение в организмах млекопитающих хитиназ и хитиназоподобных белков iii i, семейства гликогидролаз . Накопление представителей семейства является отрицательным прогностическим маркером многих воспалительных заболеваний самой различной этиологии. Имея и своем распоряжении подобные молекулы, можно идентифицировать стадию развития патологического процесса и скорректировать течение заболевания. К началу настоящей работы в нашей лаборатории при изучении белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом ПЛДГэлектрофореза был обнаружен новый водорастворимый белок, с молекулярной массой кДа, имеющий в своем составе домен по названию дрожжевою белка 4, в котором он впервые был обнаружен, или, как принято его обозначать, . Значительное содержание порядка 2 от всех водорастворимых белков обонятельного эпителия дало основание предположить важную роль 4 в обеспечении нормального функционирования эпителиальных тканей, и, возможно, защитную функцию путем участия в биогенезе мембран клеток. В результате изучения свойств белка и поиска его возможных партнеров на моделях животных с хроническим воспалением был обнаружен неизвестный белок с молекулярной массой кДа. Определено, что новый белок назван нами V является хитиназоподобным, оимсмтся к семейству гликогидролаз I и кодируется геном i. Усп. ДИК . Изучение экспрессии генов белков и 4 обонятельной выстилке животных с моделью острого воспаления показало совмести вовлечение этих белков в иммумн. Предположено, что уровень экспрессии генов гУгпо1Г п еср может являться критерием прогпошрусмости течения заболевания. Изучение свойств исследуемых белков позволило углубим, наше понимание проблемы идентификации и развития воспалительных реакций, связанных со слизистыми оболочкам. Возможно, новые белки мот быть полезны в фундаментальных исследованиях воспалительных процессов, а также найдут практическое применение в медицине, как маркеры р шпации воспалений различной этиологии. Исходя из вышесказанного, функнш пильное изучение белков обонятельною шечня, представляется весьма зн имым и интересным. В работе как сипопп. Ч. использованы термины обоняй пап и респираторный эпителий в .