Распознавание стоп-кодонов факторами терминации трансляции эукариот

• Автор: Крючкова, Полина Николаевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая схема терминации трансляции.

1.2. Факторы терминации трансляции 1го класса

1.3. Факторы терминации трансляции 2го класса

1.4. Взаимодействие 1 и 3

1.5. Распознавание стопкодонов.

1.5.1 Распознавание с гопкодонов у прокариот

1.5.2 Распознавание стопкодонов у эукариот

1.6. Влияние контекста мРНК и пептпдилтРНК на терминацию трансляции
Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .
2.1. Роль отдельных аминокислотных остатков домена в узнавании стопкодоиов
2.1.1. Аминокислотный остаток в положении переключатель специфичности факторов и человека
2.1.2. Аминокислотные остатки в домене I человека, ответственные за узнавание стопкодонов
Распознавание первого уридина в стопкодонах
Распознавание второго гуанозина в стопкодоне .
Распознавание второго аденозина в стопкодонах и
Распознавание третьего гуанозина в стопкодоне
Распознавание третьего аденозина в стопкодонах и .
2.2. Влияние фактора терминации 3 на узнавание стопкодонов
2.2.1. Влияние фактора терминации 3 на эффскгивпость терминации трансляции
2.2.2. Корректирующая активность 3 в процессе узнавания стоп
кодонов .
2.3. Модель взаимодействия стопкодонов с аминокислотными
остатками домена человека.
2.4. Участие аминокислотных остатков С домена в узнавании
стопкодонов.
2.5. Влияние Зконтекста на узнавание стопкодоиов
2.5.1. Бноинформатический анализ Зконтекстов стопкодонов в генах
человека.
2.5.2. Влияние наиболее и наименее встречающихся в геноме человека
Зконтекстов на узнавание стопкодонов
Заключение.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Штаммы бактерий и плазмиды
3.1.4. Олигонуклеотиды.
3.1.5. Среды п буферы
3.2. Методы исследования
3.2Л. Получение му гантных 1.
3.2.1.1. Получение плазмид, содержащих мутантный геи человека
Полимеразная цепная реакция ПЦР
Электрофорез ДИК в агарозном геле
Очистка фрагментов ДИК в легкоплавкой агарозе
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и реакция
лигирования ДНК
Трансформация . i плазмидной ДНК.
Выделение плазмидной ДНК из . i
Определение первичной структуры секвенирование ДНК при помощи автоматической системы i i I 0.
3.2.1.2. Экспрессия и выделение белков.
Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ
3.2.2. Получение компонентов для экспериментов i vi
3.2.2.1. Получение мРНК
3.2.2.2. Выделение рибосом.
3.2.2.3. Выделение факторов трансляции нагивных и рекомбинантных
3.2.2.4. Аминоацилирование тРНК
3.2.3. Сборка претерминационного комплекса.
Проверка качества претерминационных комплексов.
3.2.4. Функциональный анализ мутантных .
3.2.4.1. Определение эффективности терминации трансляции
3.2.4.2. Вычисление значений ксл1Км .
3.2.4.3. Определение ГТФазной активности З
4. ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


М домен вовлечен в процесс гидролиза пептидилтРНК в пепт идил грансферазном центре рибосомы, а Сконцевой домен вместе с М доменом взаимодействует с фактором терминации 2го класса, 3. В настоящее время существует ряд подходов для изучения процессов, осуществляемых факторами терминации трансляции эукариот. Вопервых, для поиска функционально важных аминокислотных остатков стали широко использовать точечный мутагенез с последующим тестированием в системах i viv и i vi. Вовторых, для локализации центров узнавания стопкодонов стали создавать химерные белки, содержащие различные участки факторов из организмов е универсальным и вариантным генетическими кодами. Несмотря на это, проблема распознавания стопкодонов у эукариот остается нерешенной, в значительной степени изза отсутствия адекватной тестсистемы для исследования этого процесса. Однако ситуация принципиально
изменилась, когда недавно была разработана новая полностью реконструированная i vi система трансляции эукариот, которая позволяет анализировать отдельно каждую из трх основных стадий трансляции, получать претерминационный и терминациониый комплексы и изучать роль каждого компонента системы отдельно и в любом сочетании 9. Известно, что и 3 кооперативно участвуют в высвобождении гюлипептидной цепи из рибосомы. Точный механизм того, как 3 содействует терминации трансляции, пока неизвестен. Одно из предположений сводится к тому, что 3 стимулирует связывание с претерминационным комплексом подобно . РНК к Асайту рибосомы с находящимся в нем смысловым кодоном 0. В настоящей работе мы попытались идентифицировать аминокислотные остатки в домене человека, ответственные за узнавание стопкодонов, выяснить роль С домена человека в узнавании стопкодонов, определить влияние 3контекста стопкодонов на эффективность терминации трансляции, а также выяснить роль 3 человека в дискриминации стопкодонов. Терминация трансляции, заключительная стадия биосинтеза полипептидной цепи, происходит в тот момент, когда в участке рибосомы оказывается один из трех стопкодонов транслируемой мРНК , или . В ответ на присутствие в сайте стопкодона с рибосомой связываются белки, получившие название факторов терминации трансляции . Они делятся на два класса 1го класса осуществляют узнавание стопкодона, передают сигнал в пептидилтраисферазный центр ПТЦ большой субчастпцы рибосомы и вызывают гидролиз пептидилтРНК, в результате чего из рибосомы высвобождается синтезированный полипептид 2го класса являются рибосомозависимыми ГТФазами, стимулирующими терминацию трансляции. У прокариот 3 увеличивает скорость рециклинга факторов 1го класса. Общая схема терминации трансляции представлена на рисунке 1. У прокариот Рис. ГДФ. После этого следует обмен ГДФ на ГТФ, что приводит к конформационным перестройкам в рибосоме, дестабилизирующим связывание факторов терминации 1го класса 1 и 2 и их диссоциации из комплекса. Далее происходит гидролиз ГТФ и диссоциация самого 3 из рибосомы, после чего с ней связывается фактор рециклинга рибосом . При помощи фактора элонгации в комплексе с ГТФ он вызывает диссоциацию малой и большой субчастиц рибосомы. После этого с малой субчастицей связывается фактор инициации 13, в результате чего происходит высвобождение мРНК и тРНК из Рсайта. У эукариот Рис. АсаЛтом рибосомы. Связывание с , 3 и ГТФ приводит к конформационным перестройкам в терминационном комплексе. Далее происходит гидролиз ГТФ, после чего сложноэфирная связь в пептидилтРНК гидролизуется под действием , и высвобождается син тезированный полипептид. До сих пор не ясно, в какой момент 3 покидает рибосому после гидролиза ГТФ пли после высвобождения пептида. Хотя рециклизация последних может осуществляться посредством иннциаторных факторов I3, и И, этот механизм без дополнительной энергии может иметь место только в ограниченном диапазоне низких концентраций . В широком
диапазоне концентраций рециклизация рибосом происходит благодаря АВСЕ1 из семейства АТФ связывающих белков ii . РНК и тРНК . Свжмкачие . Рис. I. I. Общая схема терминации трансляции у прокариот а и эукариот .