Поиск липидных маркеров, ассоциированных с риском развития поздних осложнений сахарного диабета 1 типа

• Автор: Акмурзина, Валентина Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сахарный диабет

1.1. Виды и распространенность

1.2. Стадии развития

1.3. Клиническая диагностика

1.4. Осложнения

1.5. Стадии компенсации

2. Биологическая роль липидов в организме

2.1. Фосфолипиды
2.2 Неэтерифицированные жирные кислоты
2.3. Ацилглицерины
2.4. Холестерин и его эфиры
3. Изменения липидного состава эритроцитов и плазмы при сахарном диабете 1 типа
3.1. Влияние инсулина на липидный обмен
3.2. Системное воспаление при сахарном диабете 1 типа
4. Методы исследования липидов
4.1. Извлечение липидов из образцов
4.2.Тонкослойная хроматография
4.3 Газовая хроматография
4.4. Жидкостная хроматография
4.5. Масс-спектрометрия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Обоснование выбора объектов исследования
2. Формирование групп пациентов и этапы пробоподготовки
3. Определение флсфолипидного состава эритроцитов
3.1. Выбор методики экстракции фосфолипидов из эритроцитов
3.2. Подбор условий хроматографирования и масс-спектрометрического детектирования для анализа липидного экстракта эритроцитов методом ВЭЖХ/МС
3.3. Идентификация молекулярных видов фосфолипидов методом ВЭЖХ/МС/МС
3.4. Количественный анализ фосфолипидов эритроцитов методом ВЭЖХ/МС
4. Исследование кислород-транспортных свойств эритроцитов
4.1 Лазерная интерференционная микроскопия
4.2. Спектроскопия комбинационного рассеяния
5. Определение липидного состава плазмы
5.1. Выбор методики экстракции липидов из плазмы крови

5.2. Выделение отдельных классов липидов из липидного экстракта плазмы методом твердофазной экстракции
5.3. Качественный и количественный анализ фосфолииидного состава плазмы
5.4. Определение нейтральных липидов плазмы
5.5. Определение неэтерифицированных жирных кислот плазмы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AK - арахидоновая кислота
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
ВЭЖХ/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
ВЭЖХ/МС/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-
спектрометрия/масс-спектрометрия
д-ГБ - дезоксигемоглобин
о-ГБ - оксигемоглобин
ГХ - газовая хроматография
ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия ДАГ - диацилглицерин
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ИЭР - ионизация электрораспылением
KP - комбинационное рассеяние
ЛИМ - лазерная интерференционная микроскопия
лФХ - лизофосфатидилхолин
лФЭ- лизофосфатидилэтаноламин
ЛПЛ - липопротеинлипаза
ЛПВП - липопротеин высокой плотности
ЛПНП - липопротеин низкой плотности
ЛПОНП - липопротеин очень низкой плотности
ЛХАТ - лецитинхолестеринацилтрансфераза
МАЛДИ- матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация МАГ - моноацилглицерин MC - масс-спектрометрия
МС/МС -масс-спектрометрия/масс-спектрометрия (тандемная масс-спектрометрия)
МТБЭ - метил-отре/я-бутиловый эфир МЭЖК - метиловый эфир жирной кислоты НЛ - нейтральные липиды
нф-ВЭЖХ - нормально-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография НЭЖК - неэтерифицированная жирная кислота
оф-ВЭЖХ - обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография пФЭ - плазмалоген фосфатидилэтаноламин ПИД - пламенно-ионизационный детектор ПОЛ - перекисное окисление липидов

сенсибилизатора (например, некоторые пигменты - хлорофилл, гемоглобин) или металлов (железо, свинец или медь), атакует двойные связи в жирных кислотах с образованием пероксидных соединений. Линолевая кислота окисляется в 20 раз быстрее, чем олеиновая кислота, и каждая дополнительная двойная связь в жирных кислотах увеличивает скорость окисления в 2-3 раза.
4.1. Извлечение липидов из образцов
Из-за того что липиды обычно не встречаются в свободном виде в организмах, а встроены в матрицу (мембрана клетки, липопротеины и т.д.), для их анализа необходимо выделить липиды из матрицы, удалив при этом из экстракта нелипидные соединения. Также бывают случаи, когда необходимо отделить друг от друга липиды разных классов. В настоящее время для выделения липидов из матрицы наиболее часто применяются следующие виды экстракции: жидкостная, твердофазная, сверхкритическая флюидная [80].
В жидкостной экстракции набор веществ, полученных в липидном экстракте, зависит от используемого растворителя (рис.
19). Плохо растворяясь в воде, липиды требуют особых подходов при их выделении и разделении. Важное место в исследовании липидов занимают неполярные растворители (например, гексан, петролейный эфир), которые используются для экстракции простых нейтральных липидов (например, сложных ХОЛ, ЭХ,
ТАГ). Более сложные и более полярные липиды (например, ФЛ, гликолипиды, и НЭЖК) требуют более полярных растворителей
(например, метанол или ацетонитрил). В качестве экстрагентов Рисунок 19. Схема были предложены различные растворители или комбинации
экстракции
растворителей, но наиболее частое сочетание растворителей - смесь
хлороформа и метанола в двустадийной экстракции. Этот подход был разработан в конце 1950-х Фолчем [81] и использует хлороформ-метанол в соотношении 2:1 и большие объемы солевого йодного раствора для вымывания нелипидных компонентов. Для максимальной степени извлечения отдельных интересующих липидных компонентов из матрицы были разработаны модификации метода Фолча [82-85].
В настоящее время для выделения интересующих классов липидов и для очистки липидного экстракта широко используется метод ТФЭ (рис. 20). Метод основан на распределении целевого компонента между подвижной и неподвижной фазами в