Поиск РНК-модифицирующих ферментов Escherichia coli

• Автор: Головина, Анна Янковна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Введение

Обзор литературы.

1.1. Разнообразие модификаций РНК в клетке

1.2. РНКмстилтрансферазы бактерий их структура и функции.

1.2.1. пгС и 5 мегилтрансферазы .

1.2.2. метилтрансфсразы

т6А метилтрансферазы .

т2 метилтрансферазы .

т1 метилтрансферазы .

1.2.3. суперсемейство метилтрансфераз

1.2.4. 8ЛМрадикальнос суперсемейство метилтрансфераз

1.3. Заключение .
2. Результаты и обсуждение
2.1. Поиск субстратов метилтрансфераз i, и i
2.2. Исследование метилирующей активности i и
2.2.1. Поиск ГНК, подвергающейся метилированию белками i и
2.2.2. Исследование метилтрансферазной активности i и в отношении нуклеотида .
2.3. Исследование метилирующей активности i
2.3.1. Поиск субстрата i среди малых РНК . i
2.3.2. Доказательство метилирования нуклеотида в тРНКУа метилтрансфсразой i с помощью I
2.3.3. Влияние модификации т А тРНКи на рост клеток . i в благоприятных условиях
2.3 Влияние тб3 7 в тРНКУЫ на способность клеток . i к выживанию
в стрессовых условиях.
2.3.5. Влияние т в тРНК на экспрессию генов в . i .
2.4. Разработка методики аффинного выделения субчастиц рибосомы .
2.4.1. Проверка функциональной активности полученных субчастиц, содержащих аптамер к стрептавидину
2.4.1.1. Способность к ассоциации с субчастицаии i vi .
2.4.1.2. Достаточность гена субчастиц, несуцих аптамер к стрептавидину, для выживания клеток i viv .
2.4.1.3. Способность субчастиц, несущих аптамер к стрептавидину, формировать инициаторный комплекс .
2.5. Заключение .
3. Материалы и методы .
3.1. Реактивы и биопрепараты
3.2. Буферы и растворы
3.2.1. Микробиологические среды
3.2.2. Буферы для работы с ДНК, РНК и рибосомами .
3.2.3. Буферы для аффинного выделения белков .
3.2.4. Растворы для белкового электрофореза
3.2.5. Растворы для электрофореза нуклеиновых кислот .
3.3. Трансформация клеток ii i.
3.4. Аффинное выделение метилтрансфераз , i и i
3.5. Получение рибосом и 0 экстракта для функциональных тестов .
3.6. Получение суммарных тРНК и рРНК для функциональных тестов
3.7. Ферментативное метилирование рибосом, рРНК, тРНК
и белков 0 экстракта .
3.8. Аффинное выделение индивидуальных тРНК . i .
3.9. Получение модифицированных тРНК . i .
3 Реакция кииирования 5конца олигонуклеотида
3 Анализ модификации рРНК с помощью реакции обратной транскрипции .
3 Разрезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Т1
3 Анализ олигонуклсотидных фрагментов рРНК с помощью массспсктрометрии .
3 Измерение времени удвоения клеток
3 Оценка скорости вытеснения клеток мутантных штаммов клетками дикого
типа при совместном культивировании
3 Оценка влияния тбА в тРНКУа1 на способность клеток . i к выживанию в стрессовых условиях
3 Сравнительный протеомиый анализ для изучения влияния ш6А в тРНКУа
на экспрессию генов . i
3 Серебряное окрашивание белковых гелей
3 Создание штаммов для экспрессии рибосом с аптамером к стрептавидипу в спирали а рРНК
3 Аффинное выделение рибосомных субчастиц с использованием
аптамера к стрептавидипу .
3 Выделение рибосомных субчасгиц дикого типа .
3 Анашз с помощью обратной транскрипции соотношения рРНК дикого типа
и рРИК, несущей мутации в образце
3 Аффинное выделение факторов трансляции .
3 Получение мРНК, кодирующей МКюР
3 Формирование функциональных комплексов тРНК с рибосомой
3 Реакции тоупринтинга
3 Определение степени связывания тРНК с рибосомами с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры
4. Выводы
5. Список литературы
Список сокращений
А аденин или остаток адсниловой кислоты АТР аденозинтрифосфорная кислота С цитозин или остаток цитидиловой кислоты 5 уридин5оксиуксусная кислота
2дезоксирибонуклеозид5трифосфаты А, Т, , С
гуанин или остаток гуанидиловой кислоты гуанозинтрифосфорная кислота I изопропилтиогалактопиранозид
I ixi iiii метод масс
спектрометрии, основанный на матричноактивированной лазерной десорбцииионизации
никотинамидадениндинуклеотид
I идентификатор базы данных i
8аденозилЬгомоцистеин
ваденозилЬметионин
i додецил сульфат натрия
тимин или остаток тимидиловой кислоты
i трисоксиметиламинометан
урацил или остаток уридиловой кислоты
мРНК матричная РНК
ПААГ полиакриламидный гель
ГПДР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
рРНК рибосомная РНК
РСА рентгеноструктурный анализ
ТЕМЕД МНКтетраметилэтилендиамин
тРНК транспортная РНК
ТХУ трихлоруксусная кислота
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
субчастицы . i, несущие аптамер к стрептавидину в спирали а
Введение


Анализ олигонуклсотидных фрагментов рРНК с помощью массспсктрометрии . Оценка влияния тбА в тРНКУа1 на способность клеток . Выделение рибосомных субчасгиц дикого типа . Аффинное выделение факторов трансляции . Нуклеиновые кислоты были открыты еще в конце века, и сейчас ни один исследователь не может представить себе существование живой клетки без РНК. В х годах века группа русских учных под предводительством Белозерского и Спирина показала, что большую часть РНК клетки составляет рибосомная РНК, обеспечивающая синтез всех белков. Не менее важное место в жизнедеятельности живых организмов занимают транспортная, матричная и другие малые РНК. Для осуществления нормального функционирования, поддержания необходимой структуры, эффективности и специфичности взаимодействия со своими мишенями многие РНК в особенности рРНК и тРИК претерпевают множественные химические превращения, затрагивающие, как правило, азотистые основания и рнбозу в нуклеотидах. За данные превращения ответственно огомное количество разнообразных специфических ферментов, причем в некоторых бактериальных геномах представленность их генов достигает 1 1. Жизненную необходимость модификаций РНК доказывает также существование различных механизмов контроля качества в клетке, которые приводят к быстрой деградации тРНК при со неполной модификации 2,3. Функции многих модифицированных нуклеотидов бактериальных РНК до сих пор остаются неясными, и зачастую это связано с отсутствием какихлибо данных о ферментах, осуществляющих их. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность включать и выключать в клетке соответствующую модификацию, и такие манипуляции позволяют собрать исчерпывающую информацию о се функции. Мугации нуклеотидамишени, как правило, приводят к отсутствию модификации. РНК дикого типа. РНК, возникает необходимость создать способ выделения рибосом, несущих в себе соответствующую летальную мутацию из смеси с рибосомами дикого типа. Данная работа посвящена исследованию функций трех гипотетических метилтрансфераз . Во всех живых организмах молекулы РНК различных типов подвергаются посттранскрипциопным модификациям с помощью огромного количества различных ферментов. Только к концу прошлого века количество известных природных модификаций четырех основных рибонуклеотидов превысило сотню 4. Их можно разделить на четыре основных типа Рисунок 1. Первый включает в себя изомеризацию уридмна в псевдоуридин, второй модификации азотистых оснований, такие как метилирование атомов углерода и азота, дезаминирование к примеру, с образованием инозина, восстановление двойных связей с образованием дигидроуридина, встраивание атома серы и алкилирование к примеру, изопентилнрование, треонилирование. Третий тип представлен метилированием 2гидроксила рибозы . Четвертый тип наиболее сложный это множественные модификации например, образование амино3карбоксипропилуридина, 3 I метиламино3карбоксипропилпссвдоуридина, ш1аср3Р или гипермодификации, которые формируются путем специфических обменных механизмов к примеру, кыоозин, который встречается у эубактернй и эукариот. Среди всех классов РНК транспортные РНК наиболее подвержены различным модификациям. Эти модификации обеспечивают химическое и функциональное разнообразие тРНК, а также улучшают их структурную стабильность 1. Аии
но он
сч
но он
но ОН
Рисунок 1. Примеры четырех основных тина модификаций РНК а псевдоуридинилирование Р, б метилирование атомов углерода и азота цитозина и гуанозина, соответственно т5С и т, в метилирование 2гидроксила рибозы 1, г множественные модификации уридина таср3 и гуанозина . Метилирование, одна из самых распространенных модификаций, способствует правильному сворачиванию структуры тРНК, улучшая не только процесс аминоацилирования определенными аминоацилтРНК синтетазами, но и специфичность декодирования в процессе трансляции. Рибосомная РНК также содержит множество модификаций, сосредоточенных преимущественно в функционально значимых регионах. Полный список всех модификаций рРНК и их особенностей был подробно составлен для . РНК . РНК .