Модифицированные ДНК-дуплексы с включениями тимидингликоля. Физико-химические свойства и взаимодействие с ДНК-узнающими белками

• Автор: Ян Фань
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СИНТЕЗ И СВОЙСТВА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДНКФРАГМЕНТОВ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ ТИМИДИНГЛИКОЛЯ Обзор литературы

1.1. Характеристика тимидингликоля.

1.2. Синтез фрагментов ДИК, содержащих остатки тимидингликоля.

1.3. Влияние тимидингликоля на структуру ДНКдуплекса

1.4. Взаимодействие ДЫКдуплексов, содержащих тимидингликоль,

с дистамицином А.

1.5. Репарация остатков Те в составе ДНК

1.6. Влияние тимидингликоля в составе ДНК на функционирование

полимераз
1.7. Трнфосфаты тимидингликоля и дсзоксиуридингликоля как субстраты ДНКполимсраз.
ГЛАВА И. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДНКДУПЛЕКСЫ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ ТИМИДИНГЛИКОЛЯ. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНКУЗНАЮЩИМИ БЕЛКАМИ Обсуждение результатов.
.1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с включениями
тимидингликоля
.2. Влияние остатка тимидинглнколя на устойчивость олигонуклеотидов к действию фосфодиэстсразы змеиного яда.
.3. Физикохимические свойства ДНКдуплексов, содержащих тимидингликоль
П.3.1. Зависимость устойчивости ДНКдуплексов от температуры
.3.2. Исследование свойств двуспиральных нуклеиновых кислот с номощыо акусгического метода
.3.3. Характеристика структуры ДНКдуплексов методом спектроскопии кругового дихроизма.
.3.4. Расчет равновесной структуры ДНКдуплексов, содержащих остаток тимидингликоля, методом молекулярной динамики.
.4. Взаимодействие тимидингликольсодержащих дуплексов с клеточными белками.
.4.1. Эндонуклеазы рестрикции Иго типа.
П.4.2. С5ЦИТОЗИновая Д1 1Кметилтрансфераза взоН.
.4.2.1. Взаимодействие с дуплексами, содержащими остаток тимидингликоля в участке метилирования
П.4.2.2. Взаимодействие с дуплексами, содержащими остаток тимидингликоля в регуляторном участке.
.4.3. Ядсрный фактор транскрипции 1ЧНкВ
.4.4. ДНКполимеразы и 5.
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III. 1. Реактивы и материалы
1.2. Приборы и методы.
1.3. Общие методики.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с саитнаправленными включениями тимидингликоля. Изучение влияния остатков тимидингликоля на структуру двойной спирали и термическую устойчивость модифицированных ДНКдуплексов. ЫРкВ, репликативных ДНКполимсраз р и X, с олигонуклсотидными дуплексами, содержащими в заданном положении участка узнаваниясвязывания остатки тимидингликоля изучение влияния потери ароматичности гетероциклическим основанием на функционирование указанных белков. В представленной работе с помощью синтетических ДНКдуплексов, содержащих остатки тимидингликоля, охарактеризовано влияние окислительною повреждения на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНКузпающими белками. Осуществлен дизайн и синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих один или несколько остатков тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи. Использование УФспсктроскопии и метода кругового дихроизма позволило продемонстрировать локальные нарушения двойной спирали в ТБсодержащих дуплексах и зависимость глубины этих нарушений от нуклеотидного окружения модифицированного нуклеотида. Работа включает обзор литературы, в котором рассматриваются способы получения модифицированных ДНКфрагментов с включениями тимидингликоля, их физикохимические характеристики и субстратные свойства по отношению к ферментом репарации и полимеразам различных классов. Тимидингликоль 5,6дигидро5,6дигидрокситимидип, Т1 один из основных продуктов окислительного повреждения ДНК, образуется эндогенно, в результате аэробного метаболизма 7 или посредством экзогенных факторов, таких как химическое окисление или ионизирующая радиация 8,9. Примерно повреждений генома, индуцированных ионизирующей радиацией, которая используется в терапии опухолей, представляют собой продукты фрагментации ДНК и окисленные формы тимидина, главным образом тимидингликоль. В среднем в клетке за день образуется 0 остатков Т1, которые рассматриваются в качестве маркеров окислительного стресса 1 Тимидингликоль образуется в основном путем окисления тимидина активными формами кислорода из всех оснований нуклеиновых кислот тимин наиболее легко подвергается окислительной модификации. За счет присоединения гидроксильных групп по 5ому и 6ому положениям пиримидинового цикла окисленное основание теряет ароматичность, становится неплоским и приобретает дополнительные центры для формирования водородных связей. Еще одним источником образования тимидингликоля под действием ионизирующей радиации и окислительного стресса является 5мстилцитозин. В результате его окисления образуется неустойчивый метилцитозингликоль, который подвергается гидролитическому дезаминированию, давая тимидингликоль , . Поскольку в клетках млекопитающих более последовательности СрО метилировано, Т1 по этому механизму может образовываться с большой вероятностью. Так как Те1 содержит два хиральных центра при С5 и Сбатомах, он существует в виде двух диастерсомерных пар эпимеров 1 цистрстспара 5Й, 6Б, 5Я, 1 и цистрапспара , 6И, , 6Э рис. НУ ГСНз
йЯ
он
оАнкн
НМ. НГГХСН
. Рис. Диастереомерные пары тнмидипгликоля. Я и 5Блиастереомсров Г1. В растворе тимидингликоля диастереомерные пары находятся в равновесии друг с другом рис. I1 ,б. Скорость цистрансзп им ериза пи и на нуклеотидном уровне составляет 5,8x3 мин1 2. В двойной спирали равновесие между цис и трамсэпимерами тимингликоля также реализуется, причем обогащение тем или иным диастерсомером зависит от природы нуклеотидного остатка, расположенного напротив окисленного основания 2. В настоящем обзоре рассмотрены изменения, которые вносит остаток Т1 в регулярную структуру двойной спирали. Охарактеризована способность тимидингликоля к репарации различными ферментативными системами, его мугагенные свойства и влияние на репликативные и репарирующие полимеразы. Обсуждается способность трифосфатов тимидингликоля встраиваться в цепочку ДНК в процессе биосинтеза. Особое внимание уделяется анализу стсрсохимичсских аспектов взаимодействия и функционирования белков и ферментов, узнающих остаток Т в различных биоструктурах.